李超瓊，王雪芹，劉紅占，王會(huì)芳，朱英男，田輝輝

(1.周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院,河南 周口 466001； 2.周口師范學(xué)院 新聞與傳媒學(xué)院,河南 周口 466001)

牡丹隸屬于芍藥科芍藥屬牡丹組，為多年生小灌木，具有很高的觀賞和藥用價(jià)值。自2011年牡丹籽油被批準(zhǔn)為新資源食品，油用牡丹作為一種新型木本食用油料植物引起廣泛關(guān)注。目前，國家公布的油用牡丹品種為鳳丹牡丹和紫斑牡丹，其中鳳丹牡丹以生長適應(yīng)性強(qiáng)、種子產(chǎn)量高等顯著特點(diǎn)在全國大面積種植[1-3]。牡丹籽油含有豐富的不飽和脂肪酸，主要為α-亞麻酸、油酸、亞油酸等，總不飽和脂肪酸含量可達(dá)93.23%[4-5]。α-亞麻酸屬于ω-3 系列不飽和脂肪酸，為人體不能自主合成的必需脂肪酸，是二十二碳六稀酸(DHA)和二十碳五稀酸(EPA)的前體，具有降血脂、降膽固醇、促進(jìn)大腦發(fā)育和預(yù)防心腦血管疾病等作用[1, 6-8]。

ω-3脂肪酸脫氫酶是高等植物脂肪酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，將亞油酸催化合成亞麻酸，是α-亞麻酸合成的關(guān)鍵酶[9]。在高等植物中，ω-3脂肪酸脫氫酶可分為定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的FAD3和定位于質(zhì)體的FAD7和FAD8[10-11]。目前，F(xiàn)AD7基因在擬南芥、大豆、油菜、煙草、麻瘋樹、光皮樹等多種植物中得到克隆，且發(fā)現(xiàn)FAD7基因能響應(yīng)多種環(huán)境因素，如低溫、創(chuàng)傷等[9, 12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，超量表達(dá)擬南芥FAD7基因的轉(zhuǎn)基因煙草α-亞麻酸含量增加，亞油酸含量減少，且轉(zhuǎn)基因植株抗寒能力也得到提高，在1℃低溫下仍能正常生長[15]。另外，超量表達(dá)FAD7基因的轉(zhuǎn)基因番茄抗寒性也有所增加[16]。由此可見，F(xiàn)AD7基因不僅影響植物的脂肪酸組成，還能改良植物對低溫的適應(yīng)能力。

本研究從鳳丹牡丹中克隆得到α-亞麻酸生物合成的關(guān)鍵基因PoFAD7，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析及其在不同種子發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式研究，為進(jìn)一步研究其在油用牡丹不飽和脂肪酸合成過程中的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鳳丹牡丹種植于周口師范學(xué)院試驗(yàn)田，2016年4—8月采集鳳丹牡丹不同發(fā)育時(shí)期的種子，樣本經(jīng)液氮速凍后于-80℃冰箱保存待用。

多糖多酚總RNA提取試劑盒購自北京天根，Trans 2K plus II DNA Marker、TransStar taq酶和感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RACE試劑盒、T/A克隆試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser)購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1PoFAD7基因的克隆

以鳳丹牡丹種子不同發(fā)育期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(SRA accession number： SRP051810)為基礎(chǔ)，找到一條含有部分PoFAD7基因的EST序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異引物(見表1)進(jìn)行3′-RACE。按照多糖多酚總RNA提取試劑盒操作步驟提取總RNA，檢測總RNA完整性和濃度，并按照RACE試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用已設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得PoFAD7基因3′端基因序列片段，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的EST序列進(jìn)行拼接獲得PoFAD7基因完整的開放閱讀框。以PoFAD7基因序列為模板，設(shè)計(jì)含有起始密碼子和終止密碼子的特異引物，擴(kuò)增獲得PoFAD7基因的開放閱讀框全長序列。

表1 引物序列

1.2.2PoFAD7基因cDNA序列生物信息學(xué)分析

使用在線工具ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白質(zhì)親水性預(yù)測和理化性質(zhì)分析。使用在線工具TMHMM (http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析PoFAD7 蛋白質(zhì)序列跨膜結(jié)構(gòu)域。從GenBank下載其他物種FAD7蛋白氨基酸序列，使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列相似性比對。應(yīng)用軟件MEGA5.0鄰位連接法構(gòu)建PoFAD7 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 鳳丹牡丹種子亞油酸和α-亞麻酸含量測定

自鳳丹牡丹授粉后每隔10 d采集不同發(fā)育時(shí)期的種子，在45℃烘箱中烘至恒重。采用索氏提取法提取鳳丹牡丹籽油，所得牡丹籽油經(jīng)甲酯化處理，以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 5977A Series GC/MSD System)分離和鑒定脂肪酸組分，測定干燥種子中亞油酸和α-亞麻酸的含量。具體步驟參照秦亞龍等[17]的方法。

1.2.4PoFAD7基因定量表達(dá)分析

提取鳳丹牡丹不同發(fā)育時(shí)期的種子總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA為模板，并以獲得的PoFAD7基因序列為模板設(shè)計(jì)特異性引物，以UBQ基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)檢測PoFAD7基因的表達(dá)情況。熒光定量PCR按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)試劑盒說明在儀器 CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad 公司)上進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min，95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 15 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)所用引物見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 PoFAD7基因克隆

根據(jù)鳳丹牡丹種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得951 bp的PoFAD7基因片段，依據(jù)所獲得的片段設(shè)計(jì)特異性引物，以鳳丹牡丹種子cDNA為模板進(jìn)行3′-RACE，獲得3′末端序列長度約為800 bp(見圖1)。對所獲得的基因片段進(jìn)行拼接，獲得全長cDNA序列為1 666 bp。根據(jù)所拼接的序列設(shè)計(jì)包含起始密碼子和終止密碼子的特異性引物進(jìn)行PCR，獲得包含一個(gè)完整的開放閱讀框(1 353 bp)的基因片段(見圖1)，編碼450個(gè)氨基酸(見圖2)。將該片段與拼接的PoFAD7基因序列進(jìn)行比對分析，顯示兩序列一致，表明PoFAD7基因拼接正確。

注：M. Trans 2K plus Ⅱ；1. 3′-RACE; 2.鳳丹牡丹PoFAD7基因開放閱讀框PCR產(chǎn)物。

圖1 鳳丹牡丹PoFAD7基因克隆

注：方框表示起始密碼子ATG；“*”表示終止密碼子。

2.2 PoFAD7蛋白理化性質(zhì)及氨基酸序列比對

ProtParam分析結(jié)果顯示，PoFAD7蛋白分子式為C2 359H3 543N643O631S14，理論等電點(diǎn)為9.04，相對分子質(zhì)量為51.4 kDa，理論半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為31.75，屬于穩(wěn)定蛋白，且其親水性平均系數(shù)為-0.285。應(yīng)用TMHMM在線工具分析該蛋白具有2個(gè)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于131～153、285～307位氨基酸(見圖3)，表明PoFAD7蛋白為跨膜蛋白。

將PoFAD7蛋白的氨基酸序列與其他物種中已克隆的FAD7基因的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白與已報(bào)道的FAD7蛋白超家族的保守結(jié)構(gòu)域具有高度一致性。氨基酸序列中有3 個(gè)保守組氨酸中心位點(diǎn)(HDCGH、HRTHH和HVIHH)(見圖4)，這是維持膜結(jié)合類脂肪酸去飽和酶活性所必備的結(jié)構(gòu)域[18]。另外，PoFAD7的氨基酸序列與芍藥FAD7氨基酸序列相似性最高，相似度達(dá)95%。

圖3 鳳丹牡丹PoFAD7蛋白氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

注：PoFAD7為鳳丹牡丹FAD7；NtFAD7為煙草FAD7；GmFAD7為大豆FAD7；AtFAD7為擬南芥FAD7；BnFAD7為油菜FAD7；RcFAD7為蓖麻FAD7；JcFAD7為麻瘋樹FAD7；PlFAD7為芍藥FAD7。組氨酸保守基序用方框標(biāo)注。

圖4 鳳丹牡丹PoFAD7與其他物種FAD7蛋白氨基酸序列比對分析

2.3 PoFAD7蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化

利用MEGA5.0軟件，采用鄰位連接法構(gòu)建PoFAD7 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖5。

注：FAD7和FAD3蛋白來源為擬南芥AtFAD7(NP_187727)；油菜BnFAD7(ACS16270)；蓖麻RcFAD7(AAA73511)；麻瘋樹JcFAD7(ABG49414)；煙草NtFAD7(AIA22325)；大豆GmFAD7(AEE25911)；芍藥PlFAD7(AKE44631)；鳳丹牡丹PoFAD3(ARJ54829)。

圖5 鳳丹牡丹PoFAD7與其他植物FAD7的系統(tǒng)進(jìn)化樹

由圖5可知，PoFAD7與芍藥聚為一類，親緣關(guān)系最近，這也與鳳丹牡丹和芍藥同屬于芍藥屬植物相吻合。另外，在進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)PoFAD7與已克隆的鳳丹牡丹PoFAD3蛋白[19]聚為不同分支，表明兩者雖均屬于ω-3脂肪酸脫氫酶，但功能可能不盡相同。

2.4 不同發(fā)育時(shí)期鳳丹牡丹種子的亞油酸和α-亞麻酸含量

提取鳳丹牡丹授粉后10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 d的不同發(fā)育時(shí)期鳳丹牡丹籽油并進(jìn)行亞油酸和α-亞麻酸含量分析，結(jié)果見圖6。由圖6可知，從授粉30 d后鳳丹牡丹種子亞油酸和α-亞麻酸含量開始急劇增加直至授粉后80 d。在種子發(fā)育后期鳳丹牡丹種子α-亞麻酸含量在波動(dòng)中平穩(wěn)上升，而亞油酸含量大體平穩(wěn)略有波動(dòng)。

圖6 鳳丹牡丹不同發(fā)育階段種子亞油酸和α-亞麻酸的含量

2.5 熒光定量檢測PoFAD7基因表達(dá)量

利用qRT-PCR方法和PoFAD7基因的特異引物檢測其在鳳丹牡丹授粉后不同種子發(fā)育階段的表達(dá)情況，結(jié)果見圖7。

圖7 鳳丹牡丹PoFAD7在種子不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量

由圖7可知，PoFAD7基因在種子發(fā)育的前80 d表達(dá)比較平穩(wěn)，但在種子成熟后期的90 d急劇升高并在100 d達(dá)到最高后又下降。這與牡丹籽油中α-亞麻酸主要在授粉后30～80 d急劇累積的規(guī)律并不相符，說明PoFAD7可能并不是鳳丹牡丹籽油α-亞麻酸合成的主效基因。同時(shí)此種表達(dá)模式與已報(bào)道的光皮樹SwFAD7在果實(shí)中的雙峰表達(dá)模式也不一致[14]。但牡丹籽油中亞油酸含量在授粉90 d和100 d時(shí)含量略有下降，這表明PoFAD7在催化亞油酸合成α-亞麻酸的反應(yīng)中可能也發(fā)揮了一定的作用。

3 結(jié) 論

ω-3 脂肪酸脫氫酶是多不飽和脂肪酸亞麻酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶。本研究利用鳳丹牡丹種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RACE和RT-PCR方法克隆獲得了鳳丹牡丹PoFAD7基因序列(GenBank登錄號：MK205360)，其包含完整的開放閱讀框，推測其編碼的蛋白質(zhì)含有450個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明PoFAD7蛋白具有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，含有3個(gè)保守的組氨酸基序，且系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示鳳丹牡丹與芍藥親緣關(guān)系較近?；虮磉_(dá)分析表明，PoFAD7在授粉后100 d的種子中具有較高的相對表達(dá)量。結(jié)合鳳丹牡丹種子中亞油酸和α-亞麻酸累積規(guī)律，推測PoFAD7在催化亞油酸合成α-亞麻酸的反應(yīng)中發(fā)揮一定的功能，但可能并不是α-亞麻酸合成的主效基因。