譚丙寅，吳明波，袁芳杰?

（1.武漢市第四醫(yī)院，湖北 武漢430034；2.武漢啟瑞藥業(yè)有限公司，湖北 武漢430062）

安中片收載于2015年版《中國藥典》 一部，具有溫中散寒、理氣止痛、和胃止嘔的功效，臨床上主要用于陽虛胃寒所致的胃痛，癥見胃痛綿綿、畏寒喜暖、泛吐清水、神疲肢冷，以及慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍見上述證候的治療［1］，由桂枝、高良姜、延胡索（醋制）、牡蠣（煅）、小茴香、砂仁、甘草7味藥材加工而成，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)方中使藥甘草中甘草酸含有量進(jìn)行測定，前期也僅檢索到單一成分定量測定的報(bào)道［2-4］。

中成藥復(fù)方制劑所含成分復(fù)雜，僅檢測單一成分難以全面準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其質(zhì)量，故多成分、多指標(biāo)模式已成為其質(zhì)量控制的必然趨勢，但所用對(duì)照品存在穩(wěn)定性差、難以制備、價(jià)格昂貴等不足。一測多評(píng)法通過測定1種穩(wěn)定易得價(jià)廉的對(duì)照品，利用中藥成分之間存在的函數(shù)關(guān)系實(shí)現(xiàn)多種成分同時(shí)測定，大大降低了檢驗(yàn)成本，現(xiàn)已逐步應(yīng)用于中成藥復(fù)方制劑中。因此，本實(shí)驗(yàn)采用該方法，以延胡索乙素為內(nèi)標(biāo)，建立其與肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片堿、紫堇堿、四氫小檗堿的相對(duì)校正因子，并測定安中片中各成分含有量，以期為該制劑質(zhì)量控制方法的提升提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配置Waters e2695型液相色譜儀；BP211D型電子天平（德國Sartorius 公司）；SB25-12DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。肉桂酸（110786-201604，含有量98.8%）、桂皮醛（110710-201821，含有量99.6%）、高良姜素（111699-201703，含有量99.6%）、原阿片堿（110853-201805，含有量99.6%）、延胡索乙素（110726-201819，含有量99.8%）對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院；肉桂醇（104-54-1，含有量98.0%）、四氫小檗堿（522-97-4，含有量98.0%）對(duì)照品購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；紫堇堿（518-69-4，含有量99.0%）對(duì)照品購自上?？ㄅ锟萍加邢薰?。安中片（0.2 g／片，批號(hào)18030015、18070137、18110224）購自太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫［5-7］（0～12.0 min，28.0% A；12.0～27.0 min，28.0%～49.0% A；27.0～36.0 min，49.0%～67.0%A；36.0～58.0 min，67.0%～81.0%A；58.0～65.0 min，81.0%～28.0%A）；檢測波長280 nm［2，7-8］；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.196、0.734、6.342、3.538、0.312、0.954、0.798、0.532 mg／mL 的貯備液，各精密吸取2.5 mL置于50 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（肉桂醇9.80 μg／mL、肉桂酸36.7 μg／mL、桂皮醛317.1 μg／mL、高良姜素176.9 μg／mL、原阿片堿15.6 μg／mL、延胡索乙素47.7 μg／mL、紫堇堿39.9 μg／mL、四氫小檗堿26.6 μg／mL）。

2.3 線標(biāo)溶液制備 精密吸取8種對(duì)照品貯備液各5.0 mL，置于50 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成線標(biāo)溶液Ⅰ，精密吸取適量，依次用甲醇稀釋2、4、8、16、20倍，分別作為溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。

2.4 供試品溶液制備 取片劑適量，研細(xì)，精密稱取約3.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（500 W、40 kHz）提取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.5 陰性樣品溶液制備 按照片劑處方及工藝，分別制備不含桂枝、高良姜、延胡索的陰性樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分分離度良好（均大于1.5），理論塔板數(shù)均不低于4 000，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.6.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4”項(xiàng)下線標(biāo)溶液Ⅰ～Ⅵ適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿峰面積RSD 分別為1.22%、1.03%、0.56%、0.64%、1.15%、0.71%、0.85%、1.01%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一片劑（批號(hào)18030015），按“2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿含有量RSD 分別為0.89%、1.76%、1.37%、0.45%、0.83%、1.65%、0.78%、1.86%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿峰面積RSD 分別為1.27%、1.06%、0.54%、0.61%、1.11%、0.69%、0.81%、0.99%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的片劑適量，研細(xì)，精密稱取約1.5 g，共9份，置于具塞錐形瓶中，精密加入對(duì)照品溶液（肉桂醇0.122 mg／mL、肉桂酸 0.494 mg／mL、桂皮醛4.788 mg／mL、高良姜素2.294 mg／mL、原阿片堿0.176 mg／mL、延胡索乙素0.718 mg／mL、紫堇堿0.544 mg／mL、四氫小檗堿0.372 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL，各3份，按“2.5”項(xiàng)下方法制備9份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿平均加樣回收率分別為96.98%、98.62%、99.24%、99.80%、97.63%、98.99%、98.39%、97.80%，RSD 分別為1.24%、1.41%、0.94%、0.70%、1.57%、1.18%、0.89%、1.06%。

2.7 相對(duì)校正因子計(jì)算 精密吸取“2.4”項(xiàng)下制備6個(gè)線標(biāo)溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以延胡索乙素為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他7種成分相對(duì)校正因子，結(jié)果見表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.8 耐用性考察

2.8.1 儀器、色譜柱 考察Agilent 1260、Waters e2695高效液相色譜儀，以及Diamonsil C1、Agilent Extend-C18、Hypersil ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表3，可知均無明顯影響。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.8.2 體積流量 考察0.8、0.9、1.0 mL／min 體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響。

表4 不同體積流量測得的相對(duì)校正因子Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.8.3 柱溫 考察28、30、32 ℃柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.9 色譜峰定位 取“2.5”項(xiàng)下供試品溶液，分別在“2.8.1”項(xiàng)色譜儀、色譜柱下測定，以延胡索乙素為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他7種成分相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見表6，可知均無明顯影響。

表6 各成分相對(duì)保留時(shí)間Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.10 樣品含有量測定 取3批片劑，按“2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評(píng)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表7，可知2種方法所得結(jié)果無明顯差異。

表7 各成分含有量測定結(jié)果（mg／片）Tab.7 Results of content determination of various constituents（mg／tablet）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 安中片中高良姜溫中暖胃，散寒止痛，為君藥；桂枝、小茴香助高良姜溫里散寒止痛，為臣藥；延胡索行氣止痛，煅牡蠣斂酸止痛，砂仁溫中健脾，共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。依據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物［9-10］以君藥為主，兼顧臣、佐、使藥的優(yōu)選原則，為了全面地評(píng)價(jià)安中片質(zhì)量均一性，確保臨床療效一致性，本實(shí)驗(yàn)選擇君藥高良姜代表性成分高良姜素，臣藥桂枝主要成分肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛，佐藥延胡索主要成分原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿作為指標(biāo)成分。

3.2 檢測波長選擇 采用DAD 檢測器，在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)肉桂醇在275 nm，肉桂酸在276 nm，桂皮醛在289 nm，高良姜素在266 nm，原阿片堿在288 nm，紫堇堿、延胡索乙素、四氫小檗堿在280 nm 處有最大吸收。然后，比較樣品溶液在266～289 nm 波長范圍內(nèi)的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在280 nm 處效果最佳，故選擇其作為檢測波長。

3.3 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶 劑（75% 甲 醇、甲 醇［2，4-5，11-13］、70% 乙 醇［8］、乙醇），發(fā)現(xiàn)甲醇提取時(shí)各成分綜合提取率最佳。在此基礎(chǔ)上，又考察了提取方式（超聲［2，4-5，8，11-12，14］、回流［6-7，15］提?。l(fā)現(xiàn)2種提取方法下各成分提取率差異不大，但后者雜質(zhì)成分相對(duì)較多，故選擇前者作為提取方式。同時(shí)，又考察了提取時(shí)間（20、30、40 min）。最終確定，供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測多評(píng)法同時(shí)測定安中片中肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、高良姜素、原阿片堿、延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿的含有量，實(shí)現(xiàn)了該制劑多指標(biāo)成分控制的目的，而且該方法操作簡便，重復(fù)性好，可為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。