劉博男，史 輯，賈天柱，呂彤彤，李 喆

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連116600）

肉蓯蓉為列當(dāng)科植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 或管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight 干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效［1-2］，主要用于抗疲勞、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等，對帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病有顯著療效［3］，主要成分為苯乙醇苷、生物堿等［4］。肉蓯蓉炮制歷史悠久，最早見于南北朝的《雷公炮炙論》，之后歷代文獻(xiàn)記載的炮制方法以酒制為主，包括酒洗、酒炒、酒蒸焙、酒浸、酒焙干等［5-6］，《中國藥典》 規(guī)定為酒燉和酒蒸，但兩者既耗費時間人力，又會使有效成分損失嚴(yán)重，而高壓蒸制法由于其操作簡便可控，成為近年來研究熱點［7］，但主要影響因素及評價指標(biāo)缺乏系統(tǒng)考察，故對其進(jìn)行優(yōu)化以確保飲片質(zhì)量與臨床療效很有必要［8］。本實驗采用正交試驗優(yōu)化肉蓯蓉高壓蒸制工藝，為建立該藥材省時高效的炮制方法提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Acquity H-Class UPLC 色譜儀（美國Waters 公司）；KQ-250DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；YXQLS-18 S1不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器［9］。

1.2 試藥 肉蓯蓉購自內(nèi)蒙古王爺?shù)厣惾赜邢薰?，?jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為列當(dāng)科植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖。松果菊苷（批號MUST-13080801，含有量≥98%）、異類葉升麻苷（批號MUST-15081001，含有量≥99.77%）對照品由成都曼斯特生物有限公司提供；毛蕊花糖苷（批號O0618AS，含有量≥98%）、2′-乙?；锘ㄌ擒眨ㄅ朚0601AS，含有量≥98%）對照品由美侖生物有限公司提供。甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含有量測定

2.1.1 對照品溶液制備［2］精密稱定對照品松果菊苷4.90 mg、毛蕊花糖苷4.70 mg、異類葉升麻苷5.05 mg、2′-乙?；锘ㄌ擒?.85 mg，置于5 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取不同炮制方法制成的藥材粉末（過4號篩）各1 g，置于100 mL棕色量瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，浸泡30 min 后超聲40 min，冷卻至室溫，50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得［2］。

2.1.3 色譜條件［10］ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm × 50 mm 1.7 μm）；體積流量0.4 mL／min；流動相甲醇（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0～3.5 min，10%～25% A；3.5～7.5 min，25%～35% A；7.5～11.5 min，35%～38%A；11.5～12 min，38%～100%A；12～14 min，100%A）；進(jìn)樣量1 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 線性關(guān)系考察 取對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μL，在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得松果菊苷、毛蕊花糖苷、異類葉升麻苷、2′-乙?；锘ㄌ擒辗迕娣eRSD 分別為0.18%、0.20%、0.30%、0.46%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣，測得松果菊苷、毛蕊花糖苷、異類葉升麻苷、2′-乙?；锘ㄌ擒辗迕娣eRSD 分別為0.15%、0.24%、0.41%、1.42%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批藥材6份，每份1 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣，測得松果菊苷、毛蕊花糖苷、異類葉升麻苷、2′-乙?；锘ㄌ擒辗迕娣eRSD 分別為1.78%、0.83%、1.47%、2.95%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的藥材細(xì)粉6份，每份1 g，按照1 ∶1比例加入對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣，計算回收率。結(jié)果，松果菊苷、毛蕊花糖苷、異類葉升麻苷、2′-乙?；锘ㄌ擒掌骄訕踊厥章史謩e為100.1%、100.3%、99.9%、99.8%，RSD 分別為0.3%、1.2%、0.2%、1.1%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 評價指標(biāo)確定 2015年版《中國藥典》 中肉蓯蓉指標(biāo)成分為松果菊苷和毛蕊花糖苷，而且炮制后前者含有量約為后者4倍；課題組前期發(fā)現(xiàn)，異類葉升麻苷炮制后含有量明顯升高，并且毛蕊花糖苷和2′-乙?；锘ㄌ擒沼修D(zhuǎn)換關(guān)系。因此，本實驗以綜合評分OD 值（Y）為評價指標(biāo)（Y=0.4A／Amax＋0.1B／Bmax＋0.4C／Cmax＋0.1D／Dmax，其中A～D分別為松果菊苷、毛蕊花糖苷、異類葉升麻苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷含有量，Amax～Dmax分別為各成分對應(yīng)的最高含有量）。

2.2.2 悶潤時間 取藥材6份，按1 ∶1比例加黃酒悶潤3、4、5、6、7、8 h，在0.15 MPa 壓力下蒸制4 h，取出后70 ℃下烘干，重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果見圖2，可知悶潤時間6 h 時OD 值最高。

2.2.3 加酒量 取藥材5份，按1 ∶0.3、1 ∶0.5、1 ∶0.7、1 ∶0.9、1 ∶1.1比例加黃酒悶潤6 h，在0.15 MPa 壓力下蒸制4 h，取出后70 ℃下烘干，重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果見圖3，可知加酒量1 ∶0.5時OD 值最高。

圖2 悶潤時間對OD 值的影響Fig.2 Effect of moistening time on OD value

圖3 加酒量對OD 值的影響Fig.3 Effect of wine addition on OD value

2.2.4 干燥溫度 取藥材5份，按1 ∶1比例加黃酒悶潤6 h，在0.15 MPa 壓力下蒸制4 h，取出后40、50、60、70、80 ℃下烘干，重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果見圖4，可知干燥溫度對OD 值無明顯影響。

圖4 干燥溫度對OD 值的影響Fig.4 Effect of drying temperature on OD value

2.2.5 蒸制時間 取藥材5份，按1 ∶1比例加黃酒悶潤6 h，在0.15 MPa 壓力下蒸制2、3、4、5、6 h，取出后70 ℃下烘干，重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果見圖5，可知蒸制時間4 h 時OD 值最高。

2.2.6 蒸制壓力 取藥材3份，按1 ∶1例加黃酒悶潤6 h，在0.05、0.10、0.15 MPa 壓力下蒸制4 h，取出后70 ℃下烘干，重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果見圖6，可知蒸制壓力0.05時OD 值最高。

圖5 蒸制時間對OD 值的影響Fig.5 Effect of steaming time on OD value

圖6 蒸制壓力對OD 值的影響Fig.6 Effect of steaming pressure on OD value

2.3 正交試驗 取等量、大小均勻的藥材9份，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇悶潤時間（A）、加酒量（B）、蒸制時間（C）、蒸制壓力（D）作為影響因素，OD 值作為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交表設(shè)計試驗，因素水平見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4，可知蒸制壓力（D）具有顯著影響（P＜0.05）。由此確定，最優(yōu)工藝為A1B1C1D1，即藥材加30%黃酒悶潤4 h 后，在0.025 MPa 壓力下蒸制3 h。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.3 Design and results of tests

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

然后，取3份藥材，每份30 g，按優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗證試驗。藥材打粉后按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣測 定，結(jié)果見表 5，可知工藝穩(wěn)定可 行（RSD=0.97%）。

表5 驗證試驗結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of verification tests（n=3）

3 討論

肉蓯蓉中主要含有苯乙醇苷、生物堿等活性成分，其中前者具有提高機體免疫［11］、保護(hù)神經(jīng)元［12］、減少自由基生成、抗脂質(zhì)過氧化作用［13］。2015年版《中國藥典》 中肉蓯蓉指標(biāo)成分為松果菊苷和毛蕊花糖苷；課題組前期發(fā)現(xiàn)，異類葉升麻苷炮制后含有量有所升高，毛蕊花糖苷、2′-乙?；锘ㄌ擒沼修D(zhuǎn)換關(guān)系，故本實驗選擇這4種成分含有量作為評價指標(biāo)。

肉蓯蓉傳統(tǒng)炮制方法耗時耗能，一般悶潤8 h后常壓蒸制15 h；本實驗優(yōu)化其高壓蒸制工藝，只需加30%黃酒悶潤4 h 后于0.025 MPa 壓力下蒸制3 h 即可，大大縮短了工時，并且避免該藥材長時間蒸制時有效成分的流失。另外，驗證試驗結(jié)果顯示該工藝重復(fù)性較好，具有一定的可行性。