胡瑞瑞，張家梁，郝海軍

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州450064；2.河南應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州450042；3.上海雷允上藥業(yè)有限公司技術(shù)中心，上海201401）

葫蘆素B 是從葫蘆科植物甜瓜Cucumis meloL.中提取分離得到的一種四環(huán)三萜類成分，具有抗腫瘤、抗炎、保肝等多種藥理活性［1-3］，但其水溶性極差，導(dǎo)致體內(nèi)吸收困難［4-5］。磷脂復(fù)合物可改善難溶性成分溶解度問題［6-8］，從而促進(jìn)胃腸道吸收，萬露等［6］報道，葫蘆素B 磷脂復(fù)合物可顯著增強(qiáng)其抗腫瘤作用，但該技術(shù)存在疏水性強(qiáng)、分散性及溶出度差等缺點(diǎn)［9］。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體是在固體脂質(zhì)納米粒［10-11］基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新劑型，具有穩(wěn)定性好、載藥量高等優(yōu)勢［12］。為了改善葫蘆素B 磷脂復(fù)合物疏水性強(qiáng)、溶出困難等缺點(diǎn)，本實驗將其制成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，并優(yōu)化處方，考察其粒徑、Zeta 電位、包封率、載藥量、體外釋放度、體內(nèi)藥動學(xué)行為，為該成分相關(guān)制劑的研發(fā)提供新策略。

1 材料

U3000型高效液相色譜儀（戴安中國有限公司）；SOP 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；DF-101S 型磁力攪拌器（鞏義市豫華儀器有限公司）；JY92-II 型超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新知科儀器研究所）；XW-80A 型渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；RC-6型溶出儀（天津新天光分析儀器有限公司）；Master-sizer 型粒度分析儀（英國Malvern 公司）。

葫蘆素B 對照品（批號150520，上海源葉生物科技有限公司）；葫蘆素B 原料藥（含有量98.3%，批號20161210S，上海中藥研究所）；單硬脂酸甘油酯（型號Kolliwax GMS）、泊洛沙姆188（型號WPEE587E）（德國巴斯夫公司）。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含有量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（45 ∶55）；檢測波長229 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 精密量取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液0.5 mL，加入1 mL 甲醇超聲5 min，12 000 r／min 離心45 min，精密量取0.5 mL 置于10 mL 量瓶中，定容，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取真空干燥過夜后葫蘆素B 對照品15.0 mg，置于100 mL 量瓶中，適量甲醇超聲溶解后靜置至室溫，定容至刻度，取適量用甲醇進(jìn)一步稀釋成0.05、0.5、5.0、25.0、50.0、100.0 μg／mL，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn) 行回歸，得到方程Y=2.140 6X＋0.036 8（r=0.999 9），在0.05～100.0 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗 取 0.05、50.0、100.0 μg／mL葫蘆素B 對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得葫蘆素B 峰面積RSD 分別為0.31%、0.25%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 按“2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得葫蘆素B 峰面積RSD 為0.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗 精密量取0.5、50.0、100.0 μg／mL 葫蘆素B 對照品溶液各0.5 mL，加入0.5 mL 空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，葫蘆素B 平均加樣回收率分別為98.31%、98.03%、98.82%，RSD 分別為1.12%、0.61%、0.73%。

2.2 磷脂復(fù)合物制備、純化及復(fù)合率測定［6］稱取葫蘆素B 1.12 g、大豆卵磷脂1.6 g，置于含400 mL四氫呋喃的圓底燒瓶中，于50 ℃、1 200 r／min 條件下攪拌4 h，0.45 μm 微孔濾膜過濾，除去未參加復(fù)合反應(yīng)的游離葫蘆素B，減壓旋蒸除去四氫呋喃，即得磷脂復(fù)合物粗品，再加入約50 mL 無水乙醇溶解，減壓旋蒸除去無水乙醇及殘留的四氫呋喃，真空干燥箱中過夜干燥，即得淺黃色、半固體狀態(tài)的純品。

然后，取50 ℃下1 200 r／min 攪拌4 h 后的溶液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，精密測定體積（V1），在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定葫蘆素B 質(zhì)量濃度（C1），計算形成磷脂復(fù)合物的葫蘆素B 用量W1（C1×V1），再以W1與初始葫蘆素B 投藥量（W0）的比值計算復(fù)合率。結(jié)果，葫蘆素B 復(fù)合率為（99.82 ± 0.13）%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（40.34 ±0.21）%。

2.3 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備［12］稱取磷脂復(fù)合物、單硬脂酸甘油酯、油酸適量及甲醇10 mL，置于20 mL 圓底燒瓶中，70 ℃水浴溶解，作為油相；配制20 mL 泊洛沙姆188溶液，加熱至70 ℃，作為水相，于1 200 r／min 攪拌速度下將水相緩慢加到油相中（用時約5 min），敞口繼續(xù)攪拌3 h，得到初乳，將其置于冰水混合物中繼續(xù)攪拌1.5 h后，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得（2.13 mg／mL）。同法制備不含葫蘆素B 的空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

2.4 包封率、載藥量測定 采用超濾離心法。精密量取1.0 mL 混懸液置于超速離心管中（截留分子量8 000～14 000 Da），10 000 r／min、4 ℃條件下離心45 min，測定濾液中葫蘆素B 含有量（m游離）；精密量取1.0 mL 混懸液于10 mL 量瓶中，甲醇超聲后定容，測定葫蘆素B 總含有量（m總量）。再計算包封率及載藥量，公式為包封率=［（m總量-m游離）／m總量］×100%、載藥量=［（m總量-m游離）／（m總脂質(zhì)＋m總量）］×100%，其中m總脂質(zhì)表示納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體總質(zhì)量。

2.5 處方優(yōu)化 在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，以脂質(zhì)用量（A）、固液脂質(zhì)比（B）、投藥量（C）、乳化劑濃度（D）為影響因素，包封率為評價指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交設(shè)計表。因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表2可知，各因素影響 程度依次為A ＞B ＞D ＞C，最優(yōu)處方為A1B1C2D2，即脂質(zhì)用量350 mg，固液脂質(zhì)比5 ∶1，投藥量為45 mg，乳化劑濃度1.0%。

2.6 凍干粉制備 取2 mL 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液于10 mL 西林瓶中，加入5% 凍干保護(hù)劑甘露醇，振蕩溶解后置于-75 ℃冰箱中預(yù)凍12 h 后取出，置于凍干機(jī)（起始溫度-45 ℃）2.5 h 后抽真空，以4 ℃／h 速率升溫至-10 ℃，持續(xù)36 h，即得。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.7 凍干粉表征

2.7.1 粒徑 取凍干前后樣品，蒸餾水適當(dāng)稀釋，測定其粒徑，結(jié)果見圖1。由圖可知，凍干前平均粒徑為（206.27 ± 4.93）nm，PDI 為0.167 ±0.030，而凍干后兩者分別為（224.36±8.14）nm、0.203±0.039。

圖1 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑Fig.1 Particle sizes of nanostructured lipid carriers

2.7.2 Zeta 電位 取凍干前后樣品，蒸餾水適當(dāng)稀釋，測定其Zeta 電位，結(jié)果見圖2。由圖可知，凍干前平均Zeta 電位為-（9.44±0.22）mV，而凍干后為-（8.11±0.28）mV。

2.7.3 包封率、載藥量 取凍干前后樣品，按“2.4”項下方法測定，結(jié)果見表4。由表可知，凍干過程并未破壞納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的微觀結(jié)構(gòu)。

圖2 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體Zeta 電位Fig.2 Zeta potentials of nanostructured lipid carriers

表4 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率、載藥量Tab.4 Encapsulation efficiencies and drug loadings of nanostructured lipid carriers

2.8 體外釋藥行為 蒸餾水配制供試品溶液（原料藥、磷脂復(fù)合物、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，以葫蘆素B 用量計為40 mg），置于透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），兩端扎緊，以900 mL 超聲后的蒸餾水為溶出介 質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r／min，溫度（37±1）℃，于0、1、2、4、6、8、10、12、24 h各取樣2.0 mL，同時補(bǔ)充2.0 mL 釋放介質(zhì)，測定葫蘆素B 含有量，繪制體外釋放曲線，結(jié)果見圖3。由圖可知，原料藥24 h 內(nèi)累積溶出度僅為35.64%；磷脂復(fù)合物24 h 內(nèi)累積溶出度也較低，但比原料藥略高，可能與其本身疏水性強(qiáng)、分散性較差有關(guān)［13］；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在24 h 內(nèi)累積釋放度達(dá)73.11%，明顯高于原料藥及其磷脂復(fù)合物。

圖3 樣品體外釋藥曲線Fig.3 In vitro drug release curves for samples

2.9 藥動學(xué)行為

2.9.1 灌胃液制備 取原料藥、磷脂復(fù)合物、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體凍干粉適量，置于蒸餾水中，超聲分散約30 s，即得（含葫蘆素B 5 mg／mL）。

2.9.2 給藥及取血［11］取18只大鼠（雌雄兼具），隨機(jī)分為3組，每組6只，實驗前及實驗過程中禁食，自由飲水，分別給予原料藥、磷脂復(fù)合物、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液，給藥劑量以葫蘆素B 計均為10 mg／kg，于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、10、12、16 h 眼眶后靜脈叢取血，血樣置于肝素浸潤的離心管中，3 000 r／min 離心3 min，保存于-20 ℃冰箱中。

2.9.3 供試品溶液制備 精密吸取血漿200 μL 于離心管中，加入1.2 mL 乙腈，渦旋混勻5 min 后8 000 r／min 離心15 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至空白離心管中，35 ℃氮?dú)饩徛等ビ袡C(jī)溶劑，殘留物用200 μL 乙腈復(fù)溶，8 000 r／min 離心5 min，取上清液進(jìn)樣測定。

2.9.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.3”項下25.0 μg／mL葫蘆素B 對照品溶液，乙腈逐步稀釋制成0.25、2.5、5、10、12.5、25 μg／mL，各精密吸取200 μL，35 ℃氮?dú)饩徛等ビ袡C(jī)溶 劑，加入200 μL空白血漿，渦旋混勻10 min，按“2.9.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y=8.459 0X-5.573 8（r=0.991 7），在0.25～25 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.9.5 方法學(xué)考察 取0.25、12.5、25 μg／mL 葫蘆素B 血漿對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得葫蘆素B 峰面積RSD（n=3）均小于10.26%，表明儀器精密度良好。取血漿樣品1份，于5 d 內(nèi)連續(xù)凍存和復(fù)溶，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得葫蘆素B 峰面積RSD 為3.36%，表明樣品在5 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。按“2.9.3”項下方法制備0.25、12.5、25 μg／mL 供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得平均加樣回收率分別為90.62%、91.88%、93.87%，RSD 分別為5.18%、6.41%、6.02%。

2.9.6 結(jié)果分析 表5、圖4顯示，磷脂復(fù)合物Cmax、AUC0～16h、AUC0～∞顯著高于原料藥（P＜0.05），可能與其改善藥物溶解性質(zhì)有關(guān)，在一定程度上可促進(jìn)體內(nèi)透膜吸收；制成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體后，Cmax、AUC0～16h、AUC0～∞顯著高于磷脂復(fù)合物（P＜0.01），tmax顯著降低（P＜0.05）；與原料藥、磷脂復(fù)合物比較，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體相對生物利用度分別提高到200.41%、158.22%。

表5 樣品主要藥動學(xué)參數(shù)（）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for samples（）

表5 樣品主要藥動學(xué)參數(shù)（）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for samples（）

注：與原料藥比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與磷脂復(fù)合物比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

圖4 樣品血藥濃度-時間曲線Fig.4 Plasma concentration-time curves for samples

3 討論

金珊珊等［5］制備的葫蘆素B 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率僅為（78.22±3.64）%，而本實驗將其制成磷脂復(fù)合物，經(jīng)正交優(yōu)化后包封率達(dá)到88% 左右。被包裹藥物的親脂性是影響納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率的重要因素之一［14］，葫蘆素B 脂溶性較差，制成磷脂復(fù)合物后可大大改善［6］，并能提高該成分與液態(tài)或固態(tài)載體材料的親和性，從而提高包封率。

體外釋藥行為考察結(jié)果顯示，葫蘆素B 磷脂復(fù)合物體外溶出非常緩慢，不利于藥物快速吸收進(jìn)入體循環(huán)；藥動學(xué)研究結(jié)果也表明，磷脂復(fù)合物在一定程度上提高了口服吸收生物利用度，但幅度不大［9］，將其進(jìn)一步制成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體后，其體外溶出速率及累積溶出度均有所提高，為順利吸收、提高藥效奠定基礎(chǔ)［14-16］，與磷脂復(fù)合物比較，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體相對生物利用度提高至200.41%。

磷脂復(fù)合物在一般在非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行制備，以水（質(zhì)子溶劑）混懸液形式給藥，但進(jìn)入胃腸道后會導(dǎo)致其部分重新解離開，從而失去促吸收作用［17］。制成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體后，一方面對包裹于其中的磷脂復(fù)合物具有保護(hù)作用，另一方面可發(fā)揮納米制劑促進(jìn)藥物吸收的作用，進(jìn)一步提高生物利用度。

葫蘆素B 磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液制成凍干粉是非常復(fù)雜的相變過程，加入甘露醇作為凍干保護(hù)劑后可發(fā)揮其骨架支撐作用，不但保持了納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體微觀結(jié)構(gòu)，還可使納米粒子之間不發(fā)生聚集粘連，這可能是由于甘露醇可通過其羥基與粒子表面基團(tuán)之間形成氫鍵，從而在脫水過程中與水進(jìn)行交換，抑制納米粒聚集［18］。從凍干前后平均粒徑、分布、Zeta 電位、體外釋放行為來看，凍干粉可基本保持納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的物理性質(zhì)。今后，將把研究重點(diǎn)放到葫蘆素B 相關(guān)制劑的藥效學(xué)方面，以期為其開發(fā)提供更完整的實驗數(shù)據(jù)。