房 昉 ，溫偉波，萬(wàn)春平謝雪華祁 燕宋 云，陶麗玲，楊云姣

（1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明650021；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210023；3. 云南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明650500）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為我國(guó)和發(fā)達(dá)國(guó)家肝臟疾病中的常見(jiàn)病種，嚴(yán)重危害人民健康。NAFLD 是指一種與代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）等密切相關(guān)的臨床病理綜合征，該病的主要特征是與酒精等其他明確肝損害因素?zé)o關(guān)的肝臟脂肪變性，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是其重要發(fā)病機(jī)制[1]。而胰島素敏感性及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）兩個(gè)指標(biāo)則通常被用來(lái)評(píng)價(jià)胰島素抵抗的程度[2]。高胰島素血癥（hyperinsulinism，HIS）一般多指除外胰島素瘤、使用胰島素等其他病因后，空腹胰島素或糖負(fù)荷后2 h 胰島素水平升高，HIS 經(jīng)常早于或伴隨IR 出現(xiàn)，通常被認(rèn)為是IR 的替代性參數(shù)（surrogate variable），而鑒于已有研究證實(shí)HIS 與NAFLD 的脂肪浸潤(rùn)程度密切相關(guān)[3]，所以空腹胰島素水平也是評(píng)價(jià)NAFLD 患者IR 的重要指標(biāo)。同時(shí)預(yù)防和治療MetS 是NAFLD 治療的首要目標(biāo)之一[4]，而減輕IR 又是防治MetS 的一個(gè)重要手段[5]。因此，降低空腹胰島素水平、改善IR在NAFLD 的治療中具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)觀察健肝消脂方對(duì)NAFLD 動(dòng)物模型空腹胰島素、空腹血糖、肝臟脂質(zhì)沉積等的影響，計(jì)算IR 相關(guān)指標(biāo)，并通過(guò)基因芯片技術(shù)觀察相關(guān)mRNA 表達(dá)譜差異，以期深入了解其分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD 大鼠，SPF 級(jí)，8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，共30 只，購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。使用SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)動(dòng)物，溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，并予光暗循環(huán)12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后使用。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由進(jìn)食。參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及制備 健肝消脂方由丹參、三七、莪術(shù)、山楂、黃芪、青皮、赤芍、姜黃、菊花、荷葉、甘草等組成，均購(gòu)自云南省中醫(yī)醫(yī)院中藥房，并由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑室將除三七外其他藥物采用傳統(tǒng)中藥煎煮方法制成水提液，再濃縮至相對(duì)密度為1.30～1.35（60～80 ℃）的中藥浸膏；三七經(jīng)粉碎、篩分制成三七超細(xì)粉，按處方比例加入浸膏，混勻，于0～4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及儀器 胰島素酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測(cè)定試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），葡萄糖測(cè)定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司），油紅O（上?；瘜W(xué)試劑公司），蘇木精（美國(guó)sigma-aldrich 公司），氨基烯丙基擴(kuò)增試劑盒（Amino Allyl MessageAmp II aRNA Amplification Kit，AM1753）（美國(guó)Ambion 公司）、RNA 6000 nano assay試劑盒（美國(guó)Agilent 公司）、離心機(jī)（德國(guó)Thermo Scientific Heraeus 公司），全自動(dòng)生化儀（德國(guó)羅氏公司），Spectra Maxi3x 酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），NanoDrop 1000 超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Nanodrop 公司）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 NAFLD 大鼠造模方法 參照楊坤等人方法[6]改良高糖高脂飼料（配方為：基礎(chǔ)飼料67.5%、豬油10%、蔗糖10%、蛋黃粉10%、食鹽1%、膽固醇1%、膽酸鈉0.5%）復(fù)制NAFLD 大鼠[7]。

2.2 分組及給藥[7]根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行隨機(jī)分組。首先，隨機(jī)選取10 只大鼠為空白對(duì)照組，予正常飼料喂飼；剩余20 只大鼠使用高糖高脂飼料造模（造模組）。造模組喂養(yǎng)第31 天時(shí)，空白對(duì)照組與造模組各隨機(jī)取2 只大鼠處死，行肝臟病理學(xué)檢測(cè)，以確認(rèn)造模成功。確認(rèn)造模成功后，造模組所剩18 只大鼠，再次隨機(jī)分為模型組（M 組）及治療組（Z 組），每組各9 只，均繼續(xù)予以高糖高脂飼料，連續(xù)60 d。同時(shí)Z 組根據(jù)10.86 g/kg 的生藥量灌胃給藥（按照大鼠與人的體表面積比例進(jìn)行劑量換算），每日給藥1 次，連續(xù)60 d；M 組給予相應(yīng)體積的蒸餾水灌胃，每日1 次，連續(xù)60 d。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 空腹血糖、胰島素及胰島素敏感性、HOMA-IR第60 天時(shí)，M 組及Z 組大鼠均禁食12 h，鼠尾靜脈取血，使用全自動(dòng)生化儀及葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)空腹血漿葡萄糖水平；眼底靜脈叢取血，再使用離心機(jī)分離血清，使用胰島素ELISA 測(cè)定試劑盒檢測(cè)空腹胰島素含量；胰島素敏感性=1/[空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（mIU/L）]，HOMA-IR=[空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（mIU/L）]/22.5[2]。

2.3.2 肝臟脂質(zhì)沉積 M 組及Z 組大鼠剖腹取肝右葉及左葉部分新鮮肝組織進(jìn)行冷凍切片，厚度7 μm，風(fēng)干，10%中性甲醛溶液固定，水洗，密封容器內(nèi)稀釋，油紅O 染色，60%乙醇分色；二次水洗后蘇木精淡染細(xì)胞核，1%磷酸氫二鈉沖洗，甘油明膠封固。

2.3.3 大鼠肝臟組織mRNA 表達(dá)情況[8]根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取M 組中3 只大鼠及Z 組中3 只大鼠進(jìn)行進(jìn)行肝組織mRNA 表達(dá)譜芯片檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取材均為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝右葉部分肝組織。

（1）RNA 質(zhì)檢方法

使用NanoDrop ND-1000 測(cè)定吸光度以檢驗(yàn)RNA 樣品的純度，質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)為：A260/A230≥1.5 同時(shí)A260/A280≥1.8，以排除樣品中存在蛋白、酚類物質(zhì)、芳香基團(tuán)、硫氰酸鹽及其他有機(jī)物質(zhì)的污染。RNA 完整值（RNA integrity number，RIN） 以RNA 6000 nano assay 試劑盒檢測(cè)，質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)為RIN>6?；蚪MDNA（genomic DNA，gDNA）的污染情況則通過(guò)凝膠電泳判斷。

（2）樣本制備質(zhì)控方法

使用AM1753 試劑盒獲得氨基-烯丙基反義RNA（aa-aRNA），RNA（aa-aRNA）與NHS-CyDye（Cy5）完成熒光標(biāo)記與純化后進(jìn)行芯片雜交。質(zhì)控方法：aa-aRNA 符合定量分析相關(guān)要求；同時(shí)每1000個(gè)核苷酸中，Cy5 的標(biāo)記效率應(yīng)大于15 個(gè)染料分子以上。

（3）芯片雜交質(zhì)控方法

①平均背景強(qiáng)度：Cy5 以B635 Median 表示，以Cy5＜400 為合格。

②內(nèi)部雜交控制探針（IHCs）：以IHC>37 500 為合格。

③外部質(zhì)控探針（ETQC probes & Spike-ins）：利用ETQC 外部質(zhì)控探針合成spike-ins 序列。設(shè)計(jì)低、中、高三個(gè)濃度，依spike-ins 濃度，ETQC 探針?lè)謩e呈現(xiàn)理想的高、中、低訊號(hào)監(jiān)控雜交特異性。

④背景噪音：使用48 個(gè)陰性控制探針監(jiān)測(cè)非特異性雜交，并使用Rosetta Resolver 軟件進(jìn)行計(jì)算，信號(hào)強(qiáng)度＞400 的陰性探針個(gè)數(shù)應(yīng)當(dāng)小于10 個(gè)。

⑤樣本制備完整性：使用ITQC 4，5，6 探針監(jiān)測(cè)樣本制備的完整性，應(yīng)至少2 組ITQC 探針滿足基因完整性的相關(guān)要求。

（4）基因芯片數(shù)據(jù)分析方法

將GPR 文檔加載到Limma（Bioconductor）軟件中進(jìn)行分析。

①合并重復(fù)探針：將每張芯片上相同序列的探針為重復(fù)探針，取平均值。

②訊號(hào)均一化：去除flagged probes 及控制探針后，對(duì)檢出的探針訊號(hào)進(jìn)行中位數(shù)平移。

③差異基因標(biāo)準(zhǔn)：log2|Fold change|≥1 同時(shí)P＜0.05。

④功能富集分析：生物途徑（Pathway）富集分析及基因本體（Gene Ontology，GO）分析程序使用Bioconductor 網(wǎng)站的clusterProfiler 軟件進(jìn)行，并與《京都基因與基因組百科全書》（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 定量資料統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（表示，進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；基因差異表達(dá)P 值計(jì)算方法為：基因芯片訊號(hào)進(jìn)行線性模型校正（Fit linear model），再使用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯統(tǒng)計(jì)（Empirical Bayes Statistics）計(jì)算。以上均以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

基因差異聚類分析方法為：芯片訊號(hào)值經(jīng)數(shù)據(jù)log 轉(zhuǎn)換及平均數(shù)中心化后，采用無(wú)監(jiān)督層次聚類（unsupervised hierarchical clustering analysis）分析實(shí)驗(yàn)樣本間整體基因表達(dá)的相似性。

3 結(jié)果

3.1 空腹胰島素與空腹血糖水平 Z 組與M 組比較，2 組空腹血糖水平無(wú)明顯變化，但Z 組空腹胰島素水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖2 健肝消脂方對(duì)胰島素敏感性的影響

圖3 健肝消脂方對(duì)HOMA-IR 的影響

3.2 肝臟脂質(zhì)沉積情況 經(jīng)油紅O 及蘇木精染色后，可見(jiàn)治療組肝臟內(nèi)大脂滴明顯減少，肝臟脂質(zhì)沉積明顯改善。見(jiàn)圖4。

圖4 健肝消脂方對(duì)肝臟組織脂質(zhì)沉積的影響

3.3 基因差異表達(dá)分析結(jié)果 Z 組與M 組比較肝臟mRNA 表達(dá)存在明顯差異，其中上調(diào)的基因有52 個(gè)，下調(diào)的基因有13 個(gè)，差異表達(dá)基因共65 個(gè)。見(jiàn)圖5及表1。

圖5 mRNA 差異表達(dá)的火山圖

表1 Z 組和M 組差異表達(dá)的mRNA（各前10 位）

3.4 聚類分析結(jié)果 以差異表達(dá)基因探針篩選出的前65 基因探針進(jìn)行聚類分析，可見(jiàn)M 組與Z 組基因表達(dá)有明顯差別。見(jiàn)圖6。

3.5 功能富集分析結(jié)果

3.5.1 生物途徑（pathway）富集分析結(jié)果 見(jiàn)表2。

3.5.2 基因本體（GO）富集分析結(jié)果

（1）GO 分子功能（molecular function）富集結(jié)果見(jiàn)表3。

（2）GO 生物過(guò)程（biological process）富集結(jié)果見(jiàn)表4。

（3）GO 細(xì)胞成分（cellular component）富集結(jié)果見(jiàn)表5。

圖6 基因差異表達(dá)的mRNA 聚類分析圖

表2 排序前十的生物途徑（pathway）富集結(jié)果

表3 GO（molecular function）富集結(jié)果

表4 排序前十的GO（biological process）富集結(jié)果

表5 GO（cellular component）富集結(jié)果

4 討論

研究結(jié)果顯示，雖然健肝消脂方對(duì)高糖高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD 大鼠模型空腹血糖沒(méi)有明顯影響，但是該方可以明顯降低空腹胰島素，改善胰島抵抗，并可改善肝臟脂質(zhì)沉積，其作用機(jī)制可能與肝臟基因表達(dá)有關(guān)。

根據(jù)肝臟mRNA 差異表達(dá)的功能富集分析及基因本體（GO）富集可知，健肝消脂方可以通過(guò)影響生物途徑（pathway）及GO 分子功能（molecular function）、GO 生物過(guò)程（biological process）、GO 細(xì)胞成分（cellular component）改善NAFLD 的病理生理過(guò)程。

在排序前十的生物途徑富集結(jié)果中，Toll 樣受體與NAFLD 密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)Toll 樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway），可以減輕高胰島素血癥，但未能明顯降低血糖水平，同時(shí)可減輕肝組織纖維化[9]，此外還可影響肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積[10]。丙型肝炎病毒（Hepatitis C）感染會(huì)增加胰島素抵抗的患病率[11]，而丙肝的抗病毒治療則可以改善非糖尿病、瘦型慢性丙型病毒肝炎患者的外周胰島素敏感性[12]，同時(shí)丙型病毒肝炎患者若出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，則更容易發(fā)生肝纖維化[13]。維甲酸誘導(dǎo)基因I（retinoic acid-induced gene I，RIG-I）樣受體信號(hào)通路（RIGI-like receptor signaling pathway）的泛素化修飾可激活干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）/核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路[14]。再根據(jù)肥胖動(dòng)物模型的肝臟中IRF3 的表達(dá)下降，而敲除IRF3 后肥胖動(dòng)物模型易于出現(xiàn)胰島素抵抗及脂肪變性，以及其他學(xué)者已證實(shí)經(jīng)肝臟過(guò)量表達(dá)IRF3 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可保持葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，我們可以推測(cè)RIG-I 樣受體信號(hào)通路可能通過(guò)激活I(lǐng)RF3而改善IR。IRF3 還可以抑制NF-κB 的活性[15]，而NF-κB 活性的抑制則是改善IR 的潛在分子途徑[16]。此外，RIG-I 可以激活干擾素β（interferonβ，IFNβ）[17]，而已有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)干擾素β-1a 對(duì)肝纖維化模型大鼠的肝纖維化程度有明顯的抑制作用[18]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen -activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）是IR 的經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一[19]，并參與了肝纖維化的進(jìn)程[20]，還與肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積密切相關(guān)[21]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路（VEGF signaling pathway）與脂質(zhì)的代謝關(guān)系密切，在改善胰島素抵抗方面具有重要作用[22]。VEGF活性的降低，又可能與抗肝纖維化血管新生有關(guān)[23]。并已有研究證實(shí)VEGF 基因rs833061、rs3025039 位點(diǎn)多態(tài)性與NAFLD 的發(fā)病有關(guān)[24]?；ㄉ南┧幔╝rachidonic acid，AA）對(duì)胰島β 細(xì)胞合成及分泌胰島素具有雙向調(diào)節(jié)作用[25]，同時(shí)AA 及其代謝產(chǎn)物對(duì)NAFLD 的脂質(zhì)沉積及肝纖維化均有影響[26]。

在GO 分子功能方面，上調(diào)的IRF7 可能與Toll樣受體信號(hào)通路有關(guān)[27]。而Toll 樣受體富含亮氨酸[28]，因此GO 分子功能富集中的GO：0016597（amino acid binding）可能也與Toll 樣受體信號(hào)通路相關(guān)。在GO生物過(guò)程方面，富集排序前十中的GO：0006952（defense response）可能與MAPK 信號(hào)通路有關(guān)[29]；鑒于眾所周知病毒復(fù)制與丙型肝炎病毒密切相關(guān)，因此GO 生物過(guò)程排序前十中的GO：0045069（regulation of viral genome replication）、GO：0019079（viral genome replication）可能均對(duì)丙型肝炎病毒有影響。在GO 細(xì)胞成分方面，GO：0019867（outer membrane）也可能與丙型肝炎病毒有關(guān)[30]。

健肝消脂方由丹參、三七、莪術(shù)、山楂、黃芪、青皮、赤芍、姜黃、菊花、荷葉、甘草等構(gòu)成，具有行氣消滯、活血化瘀之功[7]。方中丹參可能對(duì)VEGF 信號(hào)通路[31]、MAPK 信號(hào)通路[32]、Toll 樣受體信號(hào)通路[33]均有影響，三七可能對(duì)VEGF 信號(hào)通路有影響[34]，莪術(shù)可能對(duì)VEGF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路[35]均有影響，黃芪可能對(duì)VEGF 信號(hào)通路[36]有影響，赤芍可能對(duì)Toll 樣受體信號(hào)通路[37]、MAPK 信號(hào)通路[38]均有影響，姜黃可能對(duì)VEGF 信號(hào)通路[39]、MAPK 信號(hào)通路[40]均有影響，荷葉可能對(duì)VEGF 信號(hào)通路有影響[41]。

Toll 樣受體信號(hào)通路、丙型肝炎病毒、RIG-I 樣受體信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、花生四烯酸代謝均與IR、肝內(nèi)脂質(zhì)沉積有關(guān)，同時(shí)可能對(duì)肝纖維化有影響，其中Toll 樣受體信號(hào)通路與上調(diào)的IRF7 基因、GO 分子功能富集的GO：0016597 有關(guān)，而MAPK 信號(hào)通路與GO 生物過(guò)程富集的GO：0006952 有關(guān)。而對(duì)現(xiàn)有單味藥相關(guān)研究進(jìn)行分析可知丹參、三七、莪術(shù)、黃芪、姜黃、荷葉均可能影響VEGF 信號(hào)通路，丹參、莪術(shù)、赤芍、姜黃均可能影響MAPK 信號(hào)通路，丹參、赤芍均可能影響Toll 樣受體信號(hào)通路。因此VEGF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路可能是健肝消脂方干預(yù)NAFLD的主要分子信號(hào)通路。而c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）作為MAPK 家族中的重要一員，JNK 相關(guān)通路值得進(jìn)行深入研究。

另一方面，肝臟受損時(shí)，可能導(dǎo)致胰島素分泌增多、胰島素降解減少，易于導(dǎo)致HIS，而且HIS 的持續(xù)存在可能還是肝臟損傷時(shí)IR 的重要病因之一[42]，因此降低空腹胰島素水平可能在改善NAFLD 的IR 中具有特殊意義；我們的研究則提示了健肝消脂方降低空腹胰島素水平療效良好，同時(shí)其影響的多個(gè)生物途徑可能與肝纖維化有關(guān)，而目前已有研究證實(shí)空腹胰島素水平是NAFLD 肝纖維化的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子之一[43]，據(jù)此推測(cè)該方可能對(duì)肝纖維化治療有益。最后，該方還在生物途徑、GO 生物過(guò)程、GO 細(xì)胞成分方面影響了丙型肝炎病毒，據(jù)此推測(cè)該方可能對(duì)于丙型肝炎合并NAFLD 的患者有益。但上述推測(cè)仍待進(jìn)一步的相關(guān)研究證實(shí)。

5 結(jié)論

綜上所述，健肝消脂方可以改善IR 及肝臟脂質(zhì)沉積，其作用機(jī)制與肝臟基因表達(dá)及相關(guān)基因功能有關(guān)。其分子機(jī)制可能是該方能夠調(diào)節(jié)干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）7、GO 分子功能GO：0016597、GO 生物過(guò)程GO：0006952，并影響了MAPK 信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路。同時(shí)健肝消脂方可能在分子層面上對(duì)肝纖維化、丙型肝炎病毒在肝臟內(nèi)的復(fù)制等產(chǎn)生一定影響。另一方面，本研究雖然在尋找中醫(yī)藥治療NAFLD 的基因靶點(diǎn)方面進(jìn)行了嘗試，初步探討了健肝消脂方可能影響的相關(guān)肝臟基因，但由于NAFLD 是一個(gè)與遺傳、環(huán)境、代謝等多方面有關(guān)的復(fù)雜疾病，今后仍有待圍繞已知差異表達(dá)基因，擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步分析健肝消脂方治療NAFLD 的基因靶點(diǎn)。