林朝輝，張振宇，徐 菱，任會玲，王曉鈞

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/馬傳染病和慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊，黑龍江 哈爾濱 150069)

甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)屬于正黏病毒科流感病毒屬，為具有囊膜、分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA 病毒[1]。其宿主范圍廣泛，包括野鳥、家禽、人、馬、犬、蝙蝠等動物，能夠引起人和動物嚴(yán)重的呼吸道傳染病，對公共衛(wèi)生安全造成持續(xù)性威脅[2]。

非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 (Nonstructural protein 1，NS1)由IAV 第8 節(jié)段編碼，全長約219～237 個氨基酸，由N 端的RNA 結(jié)合區(qū)域(aa1～aa73)和C 端的效應(yīng)區(qū)域(aa74～aa219/237)構(gòu)成。NS1 蛋白主要存在于病毒感染的宿主細(xì)胞中，但仍以非常低的量存在于病毒中[3]。NS1 蛋白是一種多功能蛋白，在調(diào)節(jié)IAV 的毒力和致病力方面發(fā)揮著重要作用。一方面，NS1 蛋白與宿主因子eIF4GI 和PABP1 結(jié)合促進(jìn)了病毒mRNA 的翻譯，進(jìn)而提高了病毒復(fù)制水平，直接增強(qiáng)病毒拮抗宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)能力[4-5]。另一方面，NS1 蛋白與宿主RNA 結(jié)合阻礙了模式識別受體對RNA 的識別和下游信號通路激活，阻斷了干擾素生成[6]；同時，NS1 蛋白還可以通過與宿主因子CPSF30 結(jié)合抑制細(xì)胞pre-mRNA 的加工，進(jìn)而抑制包括抗病毒蛋白在內(nèi)的細(xì)胞蛋白合成，間接增強(qiáng)了流感病毒的致病力，促進(jìn)病毒的高效復(fù)制和感染[7-8]。雖然這些研究結(jié)果表明流感病毒NS1 蛋白與多種宿主細(xì)胞因子相互作用而調(diào)節(jié)IAV 的復(fù)制和毒力，但流感病毒的生命活動高度依賴于宿主細(xì)胞，仍有很多宿主與病毒之間的相互作用尚不清楚，因此篩選與流感病毒NS1 相互作用的宿主因子，為進(jìn)一步理解宿主因子在流感病毒感染與復(fù)制過程中所發(fā)揮的作用和制定更為有效的抗流感策略提供參考依據(jù)。

本研究以A/Sichuan/01/2009 H1N1 (H1N1 SC09)株的NS1 蛋白為“誘餌”蛋白，利用Flag pull-down聯(lián)合質(zhì)譜分析篩選到了與NS1 蛋白存在可能相互作用的宿主蛋白eIF3f，并采用雙分子熒光互補(bǔ)分析技術(shù)(BiFC)進(jìn)一步驗證其相互作用，通過在HEK293T細(xì)胞中瞬時過表達(dá)eIF3f 蛋白后促進(jìn)了H1N1 SC09病毒的復(fù)制，本研究為深入探究eIF3f 蛋白在流感病毒感染和復(fù)制中發(fā)揮的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人胚胎腎細(xì)胞株HEK293T、pcDNA3.1-Flag-HA、 pcDNA3.1-V5、 pcDNA3.1-Venus、 pcDNA3.1-SC09-NS1-Flag-4HA、 pcDNA3.1-VN-HA-SAMHD1 質(zhì)粒由本實驗室保存；H1N1 SC09反向遺傳系統(tǒng)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所陳化蘭院士惠贈；H1N1 SC09 病毒由本實驗室拯救并保存；KOD FX Neo PCR 酶購自TOYOBO 公司；無縫克隆連接酶購自Clone Smarter 公司；PolyJetTMin VitroDNA transfection reagent 購自 SignaGen 公司；TRIzol 試劑購自 Invitrogen 公司；PierceTMIP Lysis Buffer 和 PierceTMSilver Stain Kit 購自 Thermo scientific公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 購自TaKaRa 公司；SurePAGE gel 購自南京金斯瑞生物科技有限公司；DIPA 染色液和免疫染色固定液購自Beyotime 公司；細(xì)胞高糖培養(yǎng)液DMEM、抗 Flag 磁珠、TPCK 胰蛋白酶、3×Flag peptide、 Triton X-100、 Tween-20、鼠抗β-actin單抗、鼠抗HA 標(biāo)簽單克隆抗體(MAb)均購自Sigma公司；Dylight 800-labeled 山羊抗鼠IgG (H+L)購自KPL 公司。

1.2 NS1 蛋白的Flag pull-down 試驗 將HEK293T細(xì)胞接種在6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80 %時，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明，分別將1 μg/μL 的pcDNA3.1-SC09-NS1-Flag-4HA質(zhì)粒和pcDNA3.1-Flag-HA質(zhì)粒(用作陰性對照)轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，每組設(shè)置3 個重復(fù)。轉(zhuǎn)染24 h 后棄去培養(yǎng)液，分別在每孔中加入300 μL 細(xì)胞裂解液，置于4 ℃孵育10 min，細(xì)胞充分裂解后以12 000 r/min 離心10 min，吸取細(xì)胞上清與20 μL 預(yù)冷的、抗Flag 混懸磁珠混合，4 ℃孵育2 h，利用磁力架吸附磁珠，棄去上清液，用預(yù)冷的 PBS 清洗 4 次后，加入 120 μL 的 3×Flag peptide 洗脫液，4 ℃孵育 30 min 后，加入 30 μL 5×protein loading buffer，100 ℃煮沸5 min。將制備的蛋白樣品分為兩份，取一份上清經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以鼠抗HA 標(biāo)簽MAb (1∶5 000)為一抗，羊抗鼠 IgG 抗體(1∶10 000)為二抗，經(jīng) western blot 檢測NS1 蛋白的表達(dá)。。

1.3 蛋白樣品的銀染分析及質(zhì)譜分析 將1.2 中的另一份樣品經(jīng)12 % SDS-PAGE 分離后，參照銀染試劑盒說明書染色處理。根據(jù)銀染結(jié)果，比較實驗組與對照組的條帶，切取凝膠后由中國科學(xué)院生物物理研究所進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)以上實驗結(jié)果，參照GenBank 中人源eIF3f 的基因序列(NM_003754.3)，設(shè)計引物 h-eIF3f-F/h-eIF3f-R (表1)。利用 TRIzol 提取HEK293T 細(xì)胞的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，以h-eIF3f-F/h-eIF3f-R 作為引物擴(kuò)增人源eIF3f 基因片段，以 pcDNA3.1-V5 為模板，以pcDNA3.1-F/pcDNA3.1-V5-R 為引物擴(kuò)增pcDNA3.1-V5 線性載體，利用同源重組法將eIF3f 基因片段克隆到pcDNA3.1-V5 線性載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-eIF3f-V5。

以 pcDNA3.1-Venus 為模板，I-VN-F/I-VN-R 作為引物PCR 擴(kuò)增Venus 基因(全長為239 個氨基酸)的 N 端區(qū)域 VN (aa1～aa173)；以 pcDNA3.1-SC09-NS1-flag-4HA 為模板，V-NS1-F/V-NS1-R 作為引物，經(jīng)PCR 將pcDNA3.1-SC09-NS1-flag-4HA 質(zhì)粒擴(kuò)增為線性載體；利用同源重組法將VN 片段克隆到該線性載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VN-SC09-NS1-flag-4HA。

以 pcDNA3.1-Venus 為模板，I-VC-F/I-VC-R 作為引物PCR 擴(kuò)增Venus 基因的C 端區(qū)域VC (aa174～aa239)；以 pcDNA3.1-eIF3f-V5 為模板，V-eIF3f-F/V-eIF3f-R 作為引物，經(jīng) PCR 將 pcDNA3.1-eIF3f-V5 質(zhì)粒擴(kuò)增為線性載體，利用同源重組法將VC 片段克隆到該線性載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VC-eIF3f-V5。

以上所得重組質(zhì)粒均經(jīng)PCR 和測序驗證。

表1 引物序列Primer names h-eIF3f-F h-eIF3f-R pCDNA3.1-F pCDNA3.1-V5-R I-VN-F I-VN-R V-NS1-F V-NS1-R I-VC-F I-VC-R V-eIF3f-F V-eIF3f-R(5'-3')ATAGTTGTAGCCACCATGGCCACACCGGCGGTACC AGGGATAGGCTTACCCAGGTTTACAAGTTTTTCAT GGTGGCTACAACTATCAACTAAACT GGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCC ATAGTTGTAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG GGTGTTGGAGTCCATTCCGCCGCTTCCCTCGATGT ATGGACTCCAACACCATGTC GGTGGCTACAACTATCAACTAAACT ATAGTTGTAGCCACCATGGGCGGGGTGCAGCTCG CGCCGGTGTGGCCATTCCGCCGCTTCCCTTGTACA ATGGCCACACCGGCGGTAC GGTGGCTACAACTATCAACTAAACT

1.5 NS1 與eIF3f 蛋白相互作用的BiFC 檢測 將HEK293T 細(xì)胞鋪于共聚焦小皿中，待細(xì)胞密度達(dá)到50%時，將pcDNA3.1-VC-eIF3f-V5 分別與pcDNA3.1-VN-HA-SAMHD1 和 pcDNA3.1-VN-SC09-NS1-Flag-4HA 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后將細(xì)胞用免疫染色固定液室溫固定15 min，0.1 % TRIton X-100 室溫通透15 min，最后經(jīng)DIPA 染核10 min，利用激光共聚焦顯微鏡觀察NS1 與eIF3f 蛋白相互作用情況。

1.6 過表達(dá)eIF3f 蛋白對H1N1 SC09 病毒復(fù)制的影響 待6 孔板中的HEK293T 細(xì)胞密度為60 %時，分別將 1 μg pcDNA3.1-eIF3f-V5 和 pcDNA3.1-V5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，24 h 后棄培養(yǎng)液，預(yù)熱PBS清洗兩遍，用含 0.5 μg/mL 的 TPCK 稀釋液稀釋H1N1SC09 病毒，按照MOI=1 的劑量感染細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞上清液，試驗重復(fù)3 次后，利用血凝試驗測定流感病毒的HA 效價。

2 結(jié) 果

2.1 Flag pull-down 蛋白樣品的 western blot 分析將pcDNA3.1-SC09-NS1-Flag-4HA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后與抗Flag 混懸磁珠混合，常規(guī)處理后獲得Flag pull-down 樣品，對該蛋白樣品進(jìn)行western blot鑒定。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒的HEK293T 細(xì)胞在32 ku 出現(xiàn)特異性條帶，而空載體對照未見該條帶(圖1)，表明融合 Flag 標(biāo)簽的 NS1 蛋白與 - 抗 Flag磁珠結(jié)合良好，以保證其捕獲與NS1 蛋白存在潛在相互作用的宿主蛋白。

2.2 Flag pull-down 蛋白樣品的銀染分析結(jié)果 對1.2 中所得到的樣品經(jīng)12 % SDS-PAGE 分離后銀染，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SC09-NS1-Flag-4HA 質(zhì)粒的HEK293T 細(xì)胞樣品中，在140 ku 處有1 條特異性條帶，而轉(zhuǎn)染空載體的HEK293T 細(xì)胞樣品中無該條帶(圖2)，表明H1N1 SC09 NS1 蛋白捕獲到未知宿主蛋白。

2.3 蛋白樣品的質(zhì)譜分析結(jié)果 將2.2 獲得的特異性條帶經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，初步篩選獲得4個可能與H1N1 SC09 NS1 蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白，分別為：eIF3f、ENO1、CCAR2 和 PSB2 蛋白(表2)。根據(jù)蛋白評分?jǐn)?shù)據(jù)，選擇評分最高的eIF3f 蛋白進(jìn)行下一步互作驗證和功能驗證。

表2 質(zhì)譜鑒定獲得與NS1 蛋白存在相互作用的蛋白Protein description Score Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit F (eIF3f)MBP-1 of Alpha-enolase (ENOA)Cell cycle and apoptosis regulator protein 2 (CCAR2)Proteasome subunit beta type-2 (PSB2)mass 37564 sequence number 8.75 471694.2 102902 22836 3 3 42 3.51 1.79

2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定結(jié)果 利用同源重組技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-eIF3f-V5、pcDNA3.1-VN-SC09-NS1-flag-4HA、pcDNA3.1-VC-eIF3f-V5，經(jīng)PCR 檢測，結(jié)果顯示分別獲得了約為1 000 bp、1 300 bp、1 200 bp 的目的條帶，分別與 eIF3f、VN-SC09-NS1、VC-eIF3f 各片段相符(圖3)。同時，測序結(jié)果顯示各目的基因序列和各自閱讀均框均正確，進(jìn)一步表明正確構(gòu)建了以上各重組質(zhì)粒。

2.5 H1N1 SC09 NS1 蛋白與eIF3f 蛋白相互作用的驗證 利用激光共聚焦顯微鏡觀察H1N1 SC09 NS1 蛋白與eIF3f 蛋白的相互作用。結(jié)果顯示，pcDNA3.1-VC-eIF3f-V5 與pcDNA3.1-VN-SC09-NS1-flag-4HA 共轉(zhuǎn)染可見綠色熒光，而pcDNA3.1-VC-eIF3f-V5 和pcDNA3.1-VN-HA-SAMHD1 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，無綠色熒光(圖4)，表明H1N1SC09 NS1 和 eIF3f 蛋白存在相互作用。

2.6 過表達(dá)eIF3f 蛋白對H1N1 SC09 病毒復(fù)制的影響 將 pcDNA3.1-V5 和 pcDNA3.1-eIF3f-V5 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞后，利用H1N1 SC09 病毒感染細(xì)胞，測定該流感病毒的HA 效價。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-V5 的 293T 細(xì)胞經(jīng) H1N1 SC09 病毒感染后，其HA 效價為22，而過表達(dá)eIF3f 的293T細(xì)胞經(jīng)H1N1 SC09 病毒感染后的HA 效價為23(圖5)，表明eIF3f 蛋白與流感病毒NS1 結(jié)合促進(jìn)H1N1 SC09 流感病毒的復(fù)制。

3 討 論

本研究通過Flag pull-down 聯(lián)合質(zhì)譜的方法，在HEK293T 細(xì)胞中篩選出與流感病毒NS1 蛋白存在直接或間接相互作用的宿主蛋白，經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析鑒定出4 個與NS1 存在潛在相互作用的宿主蛋白，分別是 eIF3f、ENO1、CCAR2 和 PSB2 蛋白。

真核翻譯起始因子3 (The eukaryotic initiation factor 3，eIF3) 是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)最復(fù)雜的起始因子之一，由eIF3a～eIF3m 等13 個亞基組成。eIF3 是啟動真核細(xì)胞蛋白和病毒蛋白合成所必需的，并且在調(diào)控真核細(xì)胞周期和癌癥發(fā)生過程中均具有重要作用[9]。eIF3f 為eIF3 的重要組成部分，具有參與翻譯起始、pre-mRNA 剪接和轉(zhuǎn)錄等進(jìn)程的功能[10]。已有研究表明eIF3f 蛋白在胃癌和小腸癌等癌細(xì)胞中有較低水平表達(dá)，過表達(dá)eIF3f 能夠抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)黑色素瘤、胰腺癌細(xì)胞凋亡，表明eIF3f 蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期和癌癥發(fā)生過程，是細(xì)胞生長和增殖的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子[11]。此外，eIF3f 參與調(diào)控HIV-1 的復(fù)制，eIF3f 和N91-eIF3f 通過特異性靶向HIV-1 mRNA 的3' 長末端重復(fù)區(qū)域，導(dǎo)致細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中病毒mRNA 的水平降低；并且在病毒mRNA 成熟過程中，eIF3f 可以特異性地干擾mRNA 的3'末端加工，限制HIV-1 的復(fù)制[12]。

為驗證宿主eIF3f 蛋白與流感病毒NS1 蛋白的相互作用，本研究通過免疫共沉淀試驗發(fā)現(xiàn)NS1 與eIF3f 蛋白存在微弱的相互作用(數(shù)據(jù)未給出)，推測可能原因為NS1 蛋白與eIF3f 蛋白之間的作用時間短，解離速度快。而BiFC 技術(shù)可以通過可視化直觀、快速地判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用[13]，BiFC 結(jié)果顯示，流感病毒NS1 蛋白與宿主eIF3f 蛋白在HEK293T 細(xì)胞中結(jié)合，使各自攜帶的Venus 蛋白片段在空間上相互靠近互補(bǔ)，重新構(gòu)建成完整的具有活性的Venus 蛋白分子，在激發(fā)光的激發(fā)下，產(chǎn)生Venus 蛋白的熒光，表明二者存在相互作用。在HEK293T 細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)eIF3f 可以提高H1N1 SC09 病毒的復(fù)制水平，但eIF3f 蛋白如何通過結(jié)合NS1 蛋白調(diào)控流感病毒復(fù)制的機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究首次證實了宿主eIF3f 蛋白與NS1 蛋白的相互作用，并且eIF3f 蛋白對流感病毒的復(fù)制發(fā)揮正調(diào)控作用。該研究不僅揭示了宿主eIF3f 蛋白在調(diào)控流感病毒復(fù)制中的新功能，也為揭示流感病毒復(fù)制和感染機(jī)理提供實驗依據(jù)。