薛振宇，崔鵬飛，谷文麗，韓舒雨，張?jiān)?，?鑫，彭大新，鄧國(guó)華，陳化蘭

(1.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069)

禽流感病毒(AIV)是一種單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA 病毒[1]。H4 亞型AIV 在亞洲、歐洲及北美國(guó)家中廣泛流行；且宿主廣泛，在野鳥(niǎo)和家禽中均有分布[2-6]。此外，H4 亞型AIV 的跨物種感染也偶爾發(fā)生。1999年，從患有肺炎的豬中首次分離出H4N6 亞型AIV[7]。血清流行病學(xué)顯示，在美國(guó)和黎巴嫩的家禽養(yǎng)殖工人體內(nèi)檢測(cè)出了針對(duì)H4 亞型AIV 的特異性抗體[8-9]。某些H4 亞型AIV 無(wú)需事先適應(yīng)便可以直接感染小鼠，具有人類(lèi)受體結(jié)合特異性[5]。這表明H4 亞型AIV 對(duì)哺乳動(dòng)物宿主構(gòu)成潛在威脅。此外，H4 亞型AIV 可與其它流感病毒共同傳播并重新配對(duì)[10]。因此，H4 亞型AIV 對(duì)家禽生產(chǎn)和公共健康均可能構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

盡管監(jiān)測(cè)研究表明H4 亞型AIV 在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，但H4 亞型AIV 的生物學(xué)特性尚未得到很好的研究。目前國(guó)內(nèi)報(bào)道過(guò)的H4 亞型AIV 的NA 亞型多為 N2、N6 和 N8 亞型[11]。為了解 H4N8亞型AIV 的生物學(xué)特性，初步評(píng)價(jià)其對(duì)哺乳動(dòng)物的感染致病情況，本研究對(duì)2018年從重慶分離得到的一株鴨源H4N8 亞型AIV 進(jìn)行全基因組測(cè)序、遺傳進(jìn)化分析及BALB/c 小鼠的感染性試驗(yàn)，為H4 亞型AIV 的遺傳進(jìn)化特征及綜合防控奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8) 由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室于2018年春季分離于重慶市長(zhǎng)壽區(qū)鳳城街道黃桶灣市場(chǎng)，并鑒定、保存；9日齡～11日齡SPF 雞胚購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；6 周齡雌性BALB/c 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑 病毒RNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑購(gòu)自Promega 公司；rTaqDNA 聚合酶購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega 公司；測(cè)序反應(yīng)試劑盒BigDye Terminator 3.1 購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。

1.3 病毒增殖、純化及雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定 將病毒原液用含雙抗(青霉素和鏈霉素)的PBS 10 倍倍比稀釋?zhuān)臃N于9日齡～11日齡SPF 雞胚中，37 ℃孵化48 h 后收取最高稀釋度最高血凝價(jià)的雞胚尿囊液。如此純化3 代后分裝凍存于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒓兓蟮牟《?0 倍倍比稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度接種 5 枚 9日齡～11日齡 SPF 雞胚，37 ℃孵化48 h 后記錄每個(gè)稀釋度雞胚的血凝陽(yáng)性數(shù)目，根據(jù)Reed-Muench 方法計(jì)算病毒的EID50。

1.4 全基因組測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析

1.4.1 目的片段的擴(kuò)增按照病毒RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，通用引物12 bp (5'-AGC AAAAGCAGG-3')作為反轉(zhuǎn)錄引物，將病毒RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。從 GenBank 中下載 H4 亞型 AIV 的各節(jié)段序列，利用其非編碼區(qū)保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增目的片段。利用膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增片段純化回收。

1.4.2 病毒全基因組序列測(cè)定及分析根據(jù)測(cè)序試劑盒BigDye Terminator 3.1 說(shuō)明書(shū)對(duì)病毒各節(jié)段進(jìn)行序列測(cè)定，并利用SeqMan 軟件進(jìn)行序列拼接。將得到的完整序列利用MEGA5.0 軟件進(jìn)行分析并繪制HA 基因進(jìn)化樹(shù)。

1.5 病毒對(duì)小鼠的感染性試驗(yàn) 將感染組的8 只小鼠利用干冰輕度麻醉，每只小鼠以106EID50/50 μL病毒劑量進(jìn)行鼻腔接種。對(duì)照組5 只小鼠接種PBS作為陰性對(duì)照。感染后的14 d 內(nèi)每日記錄小鼠的體質(zhì)量變化及死亡情況，其中在感染后的第3 d 隨機(jī)抽取感染組3 只小鼠，取其臟器(腦、鼻甲、脾、腎、肺)并進(jìn)行病毒滴定。

2 結(jié) 果

2.1 病毒全基因組序列測(cè)定及進(jìn)化分析 對(duì)病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)的全基因組測(cè)序，利用SeqMan 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接。將得到的完整序列利用NCBI 進(jìn)行Blast 比對(duì)，得到與病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)基因節(jié)段同源性最高的病毒。除NA 和NS 基因與H3N8 流感病毒同源關(guān)系密切以外，其余節(jié)段來(lái)源均不同(表1)。

表1 與病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)各基因節(jié)段核苷酸同源性最高的病毒株基因Gene PB2 PB1 PA HA NP NA M NS最高同源性病毒株Highest homologous strain A/bean goose/Hubei/SZY200/2016(H11N9)A/chicken/Japan/AQ-HE144/2015(H5N6)A/wild goose/Dongting lake/121/2018(H6N2)A/duck/Mongolia/OIE-7438/2011(H4N6)A/chicken/Ganzhou/GZ157/2016(H3N2)A/muscovy duck/Vietnam/LBM529/2013(H3N8)A/pigeon/Guangxi/128P9/2012(H3N2)A/muscovy duck/Vietnam/LBM240/2012(H3N8)同源性%Homology%98.4 97.1 98.9 96.7 98.1 98.2 99.0 99.0登錄號(hào)Accession No.KX121185.1 LC208495.1 MH727479.1 AB701294.1 KY415766.1 AB916669.1 KT022292.1 AB786919.1

2.1.1 HA基因序列特殊位點(diǎn)及其進(jìn)化分析A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)分離株 HA 基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1 695 nt，共編碼565 個(gè)氨基酸。HA 蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為338PEKASR↓GLF346，只有一個(gè)堿性氨基酸，符合低致病性AIV (LPAIV)的分子特征。其具有6 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別為 ：18NYT20、34NGT36、178NLT180、222NQT224、310NIS312、497NGT499。除了497NGT499位于HA2 亞基以外，其余5個(gè)均位于HA1 亞基。進(jìn)化分析結(jié)果顯示病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)屬于歐亞分支，與病毒 A/duck/Mongolia/OIE-7438/2011(H4N6)的 HA基因同源性最高，同源性為96.7 % (圖1)。表明該病毒的HA 基因可能與病毒A/duck/Mongolia/OIE-7438/2011 (H4N6)的HA 基因具有較近的親緣關(guān)系。

2.1.2 NA基因序列特殊位點(diǎn)及其進(jìn)化分析A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)分離株NA 基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1 413 nt，共編碼470 個(gè)氨基酸，NA 蛋白莖部無(wú)缺失且具有6 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別為46NET48、54NET56、88NNT90、148NGT150、272NFS274、297NWT299。NA 基因與病毒 A/muscovy duck/Vietnam/LBM529/2013 (H3N8)的 NA 基因同源性最高，達(dá)98.2 % (表1)。表明該病毒的NA 基因可能與病毒A/muscovy duck/Vietnam/LBM529/2013(H3N8)的NA基因具有較近的親緣關(guān)系。

2.1.3 內(nèi)部基因序列特殊位點(diǎn)分析及其進(jìn)化分析堿性聚合酶蛋白2 (PB2)中T271A、E627K 和D701N 的突變對(duì)哺乳動(dòng)物流感病毒的毒力和傳播起重要作用[12-13]，病毒 A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)的 PB2 蛋白未出現(xiàn)以上突變。PB1 蛋白中與毒力相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)Y436H 未發(fā)生突變。M2 蛋白并未出現(xiàn)抗金剛烷胺藥物的氨基酸位點(diǎn)S31N 的突變[14]。NS1 蛋白存在與增強(qiáng)小鼠致病性相關(guān)的特殊氨基酸位點(diǎn)42S 和149A[15]，表明其具有增強(qiáng)對(duì)小鼠致病力的能力。序列分析結(jié)果顯示病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)的內(nèi)部基因分別與 H11N9、H5N6、H6N2、H3N2 和H3N8 具有較高同源性(表1)，其中酸性聚合酶蛋白(PA)基因與野鳥(niǎo)源病毒A/wild goose/Dongting lake/121/2018 (H6N2)親緣關(guān)系密切，表明其基因來(lái)源廣泛。

2.2 病毒對(duì)BALB/c 小鼠的感染性試驗(yàn) 將病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)以 106EID50/50 μL劑量對(duì)BALB/c 小鼠進(jìn)行鼻腔接種，在接種后的14 d觀察期內(nèi)未見(jiàn)到小鼠出現(xiàn)任何明顯的臨床癥狀，感染組小鼠體質(zhì)量也與對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖2)，表明感染組小鼠呈現(xiàn)低致病性特征。臟器滴定結(jié)果顯示，病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)在小鼠鼻甲和肺臟中均可以有效復(fù)制，病毒滴度分別為2 log10 EID50/mL 和 3.33 log10 EID50/mL，但在腦、脾及腎中均未檢測(cè)到病毒的復(fù)制(圖3)，表明其具有感染哺乳動(dòng)物的潛力。

3 討 論

由于AIV 的人畜共患性質(zhì)，如何對(duì)該病預(yù)防和控制受到廣泛密切關(guān)注。2013年在中國(guó)暴發(fā)的H7N9 人類(lèi)感染事件說(shuō)明LPAIV 也會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)嚴(yán)重感染，甚至死亡。因此，加強(qiáng)對(duì)LPAIV 的關(guān)注是至關(guān)重要的。本研究對(duì)2018年春季從我國(guó)重慶分離得到的一株鴨源H4N8 亞型AIV 進(jìn)行了部分生物學(xué)特性分析。其遺傳演化分析結(jié)果表明，該病毒基因來(lái)源廣泛，除了 NA 基因及 NS 基因與 A/Muscovy duck/Vietnam/LBM240/2012(H3N8)的同源關(guān)系密切以外，其余節(jié)段的來(lái)源均不同。其中PB2 基因、PB1基因和PA 基因分別與H11N9、H5N6、H6N2 流感病毒同源關(guān)系密切，核蛋白(NP)基因和基質(zhì)蛋白(M)基因與H3N2 流感病毒同源關(guān)系密切，可見(jiàn)其遺傳多樣性。并且該病毒的8 個(gè)基因節(jié)段的宿主來(lái)源豐富，有家禽及野禽，也有水禽及陸生禽類(lèi)，可見(jiàn)該病毒的重組情況復(fù)雜，也為其他病毒的重組提供了更多可能。特殊位點(diǎn)結(jié)果顯示，病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8) HA 蛋白裂解位點(diǎn)處只具有一個(gè)堿性氨基酸，表明其具有LPAIV 的分子特征。NA 蛋白莖部缺失對(duì)病毒的復(fù)制和致病力具有一定的影響，該病毒沒(méi)有發(fā)生NA 蛋白的莖部缺失。PB2 基因中的T271A、E627K 和D701N 的突變能夠增強(qiáng)AIV 在哺乳動(dòng)物中的毒力和傳播能力，病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)在這些位點(diǎn)均無(wú)突變，表明其并不具備增強(qiáng)AIV 在哺乳動(dòng)物中致病力的能力。除NS1 蛋白上具有增強(qiáng)對(duì)小鼠感染能力的特殊位點(diǎn)42S 和149A 外，其余蛋白均不具備增強(qiáng)病毒毒力的位點(diǎn)。小鼠感染性試驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒可以在小鼠的鼻甲及肺中有效的復(fù)制，可見(jiàn)其具備感染哺乳動(dòng)物的潛力。感染后小鼠并未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，且體質(zhì)量變化與對(duì)照組無(wú)明顯差異，表明該病毒對(duì)小鼠呈現(xiàn)低致病性特征。有研究報(bào)道過(guò)H4N8病毒在小鼠的肺內(nèi)傳代至第11 代時(shí)會(huì)對(duì)小鼠表現(xiàn)出很好的適應(yīng)性及高致病性[16]，可見(jiàn)該亞型病毒雖然呈現(xiàn)低致病性，但卻不僅可以感染哺乳動(dòng)物，而且具有對(duì)哺乳動(dòng)物表現(xiàn)出高適應(yīng)性及高致病性的潛在危險(xiǎn)，所以對(duì)LPAIV 的持續(xù)跟蹤監(jiān)測(cè)顯得非常必要。

H4N8 亞型AIV 在亞洲國(guó)家很少被分離到，可能由于監(jiān)測(cè)力度還不夠，也有可能因?yàn)樵搧喰筒《窘诓疟灰雭喼薜貐^(qū)，所以該亞型病毒可能正在擴(kuò)大流行區(qū)域。有研究發(fā)現(xiàn)從北海道東部的濱鳥(niǎo)中分離出的H4N8 亞型AIV 可以引起禽類(lèi)嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，甚至導(dǎo)致小鼠死亡[2]?？梢?jiàn)該亞型AIV不僅可以感染禽類(lèi)，還可以跨物種感染哺乳動(dòng)物，所以H4 亞型AIV 的潛在危害不容忽視。新型流感病毒一般是由基因重排引起的，而H4 亞型AIV 基因節(jié)段來(lái)源廣泛，具有遺傳多樣性，可能更易發(fā)生基因重排，并為其他亞型AIV 提供基因片段。若是宿主混合感染LPAIV 和HPAIV，可能會(huì)改變HPAIV 的生物學(xué)特性，增加對(duì)該病的防控難度[17]。因此，加強(qiáng)對(duì)H4 亞型AIV 的研究顯得尤為重要。