姚曉雨，王 斌，劉宇婷，張 晶，劉 鑫，鄭永輝

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室- 美國密歇根州立大學天然免疫聯(lián)合實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 201100)

流感病毒是負鏈RNA 病毒，為正黏病毒科，流感病毒屬成員。目前按照核蛋白和基質(zhì)蛋白的抗原性，可以將流感病毒劃分為A、B、C、D 4 類。其中A 型流感病毒具有較為廣泛的生物學宿主，可以感染人和多種動物，給公共衛(wèi)生安全帶來了沉重的負擔[1-3]。流感病毒為I 型包膜病毒，其進入靶細胞的過程需要膜糖蛋白的介導，流感病毒介導膜融合的包膜蛋白為血凝素蛋白(HA)。HA 蛋白在自然條件下是以三聚體的形式存在于病毒包膜上，而每個HA 單體是由 HA1 和HA2 以二硫鍵連接組成的。HA 是流感病毒囊膜表面纖突結(jié)構(gòu)的主要成分，其可在動物體內(nèi)誘導中和抗體的產(chǎn)生，是流感病毒毒力的重要決定因子[4-8]。流感病毒感染宿主細胞后，釋放的核糖核蛋白復合物(RNPs)利用宿主細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成機制，在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯合成病毒自身蛋白。HA 蛋白作為一種高度糖基化的蛋白，其生物合成受到宿主細胞的嚴格調(diào)控。首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成糖基化的HA0 蛋白前體模式，隨后又在高爾基體中進一步加工，后被宿主蛋白酶切割為HA1 和HA2 亞單位[5]。在HA 蛋白合成過程中，需進行糖基化、?；确g后修飾以及宿主蛋白酶的切割，最終成熟的HA 被轉(zhuǎn)運到膜上以用于子代病毒粒子的組裝[8]。

蛋白在宿主細胞內(nèi)的成熟是一個合成和降解的動態(tài)平衡過程[9]。即使在正常生理條件下，細胞中有30 %新合成的蛋白由于錯誤折疊而被降解，而當細胞處于應激狀態(tài)時，被降解的蛋白數(shù)量可能會更多[9-11]。本實驗室前期研究證明流感病毒HA 蛋白能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ERAD)途徑被蛋白酶體降解，同時發(fā)現(xiàn)部分HA 蛋白也被溶酶體降解[12]，而其機制尚不明確。本研究嘗試闡明宿主細胞通過溶酶體途徑降解流感病毒HA 蛋白的機制，為開發(fā)新的抗病毒手段奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人胚胎腎細胞293T 及Atg3 基因敲除的293T 細胞、質(zhì)粒pXBP1u-Luc、pCS-H5HA由本實驗室保存；GFP-250 質(zhì)粒由Elizabeth Sztul 惠贈；表達偽狂犬病毒(PRV) gE 蛋白的重組質(zhì)粒PRV-gE 及鼠源抗gE 蛋白單克隆抗體(MAb)由田志軍研究員惠贈；Lamp2a siRNA 購自GenePharma 公司；聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染試劑(Polyethylenimine，PEI)購自 Polyscience公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineRNAiMAX 購自 Invitrogen 公司；二甲基亞砜(DMSO)、溶酶體抑制劑BafilomycinA1(Baf-A1)、自噬抑制劑 Wortmannin 購自 Sigma 公司；抗 H5N1-HA 兔源多克隆抗體購自SinoBiological；兔源抗Atg3 MAb購自Cell Signaling Technology；兔源抗LC3 多克隆抗體、鼠源抗β-actin MAb 均購自Sigma 公司；羊抗兔和羊抗鼠IgG-HRP 購自Jackson 公司。

1.2 HA 蛋白過表達對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的檢測 細胞中錯誤折疊的蛋白可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，而細胞為了維持自身穩(wěn)態(tài)可通過特定通路將錯誤折疊蛋白直接降解。當細胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)時，可啟動X 盒結(jié)合蛋白1 (Xbp1)的剪切。為了驗證HA 蛋白由于自身錯誤折疊而引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，本研究檢測了細胞過表達HA 蛋白是否促進Xbp1 的剪切。將野生型293T 細胞以4×105細胞/ 孔的密度接種于六孔細胞培養(yǎng)板，待細胞密度達到70 %～80 %時，利用3 μg PEI 將 1 μg pCS-H5HA 與 1 μg pXBP1u-Luc 按照常規(guī)方法共轉(zhuǎn)染細胞，同時將空質(zhì)粒與pXBP1u-Luc 共轉(zhuǎn)染作為陰性對照。轉(zhuǎn)染后4 h 更換新鮮培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞，利用RIPA 裂解細胞，取25 μL 細胞裂解液置于檢測板中，再加入25 μL螢光素酶檢測底物，利用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性，其大小反應了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的相對強弱。

1.3 HA 蛋白溶酶體降解的驗證 為了驗證錯誤折疊的HA 蛋白是否通過溶酶體通路降解，按照前述方法將2 μg pCS-H5HA 轉(zhuǎn)染至 293T 細胞中，轉(zhuǎn)染后24 h，向細胞中添加溶酶體抑制劑Baf-A1 (終濃度為100 nmol/L)，以DMSO 處理細胞作為陰性對照。抑制劑處理細胞24 h 后，收集細胞并裂解，蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 檢測后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5 %脫脂乳封閉 30 min，分別以 1∶2 000 稀釋的抗H5N1-HA 兔源多克隆抗體和1∶2 000 稀釋的鼠源抗β-actin MAb 作為一抗，羊抗兔和羊抗鼠IgG-HRP(1 ∶5 000)為二抗，western blot檢測HA蛋白及β-actin 的表達，蛋白的相對表達量經(jīng)由ImagJ 軟件計算分析。

1.4 Western blot 檢測分子伴侶介導的自噬(CMA)情況 溶酶體相關(guān)膜蛋白2a (Lamp2a)是溶酶體膜上的受體，是CMA 途徑的主要功能性分子[13]。本研究通過檢測抑制Lamp2a 蛋白表達的293T 細胞中HA 蛋白的表達來檢測HA 蛋白是否通過CMA 途徑降解。首先對購自GenePharma 公司的針對Lamp2a基因的干擾RNA 進行效率驗證。RNA 序列如表1所示。

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利用LipofectamineRNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑，將40 pmol 各siRNA 轉(zhuǎn)染至6 孔板中的生長狀態(tài)良好的293T 細胞中，轉(zhuǎn)染后 24 h 收集細胞，以 1∶1 000 稀釋的兔源抗Lamp2a 多克隆抗體為一抗，羊抗兔IgG-HRP (1∶5 000)為二抗，western blot 檢測 Lamp2a的表達水平，篩選出針對于Lamp2a 干擾效率最高的siRNA 用于后續(xù)試驗。將相應的Lamp2a 特異性siRNA 及對照組 siRNA 轉(zhuǎn)染 293T 細胞后 24 h，將細胞再次轉(zhuǎn)染1 μg pCS-H5HA，24 h 后收集細胞，以H5N1 兔源多克隆抗體(1∶2 000)為一抗，羊抗兔IgG-HRP (1∶5 000)為二抗，western blot 檢測 HA 蛋白，同樣以上述抗體濃度檢測Lamp2a 的表達，分析CMA 途徑阻斷后，HA 蛋白的表達變化。

1.5 ELISA 檢測內(nèi)吞途徑是否參與HA 蛋白的降解為驗證內(nèi)吞途徑是否參與HA 蛋白的降解，進行了溫度依賴的蛋白內(nèi)化試驗[14]。HA 蛋白為囊膜糖蛋白，其在宿主細胞內(nèi)合成成熟后，被轉(zhuǎn)運至細胞膜表面，如果細胞表面的HA 蛋白經(jīng)過內(nèi)吞途徑被降解，那么當?shù)鞍椎募毎麅?nèi)吞被激活以后，細胞表面HA 蛋白的數(shù)量則相應減少。本試驗按照3×104細胞/ 孔的密度將293T 細胞鋪于多聚賴氨酸處理的96孔細胞培養(yǎng)板中，pCS-H5HA 轉(zhuǎn)染2 個96 孔板，標記為 1 號板和 2 號板，PRV-gE 轉(zhuǎn)染 2 個 96 孔板，標記為3 號板和4 號板，4 個96 孔板每孔轉(zhuǎn)染0.02 μg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h 后，輕輕棄掉細胞培養(yǎng)液，抗體使用5 %的BSA 稀釋，1 號板和2 號板以抗H5N1-HA兔源多克隆抗體(1∶2 000)孵育，3 號板和4 號板孵育鼠源抗 gE 蛋白 MAb (1∶1 000)，每孔加入 100 μL稀釋后的抗體，4 ℃孵育1 h 后，1 號板和3 號板以4 %的多聚甲醛室溫固定30 min，2 號板和4 號板重新加入100 μL Opti-MEM 板置于37 ℃培養(yǎng) 45 min，以相同方法固定，PBS 洗滌4 個96 孔板兩次，加入羊抗鼠或羊抗兔IgG-HRP (1∶5 000)為二抗，室溫孵育1 h 后，加入TMB 和終止液3 mol/L 硫酸終止反應，進行ELISA 檢測，采用酶標儀測定OD450nm值，檢測低溫條件下(1 號板和3 號板)和當細胞重新置于37 ℃后(2 號板和4 號板)細胞膜表面的HA 蛋白。

1.6 自噬通路降解 HA 蛋白的檢測 將 2 μg pCS-H5HA 轉(zhuǎn)染293T 細胞，轉(zhuǎn)染后24 h，向細胞中添加自噬抑制劑Wortmannin (終濃度為100 nmol/L)，以DMSO 處理細胞作為陰性對照，轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞，提取細胞可溶性總蛋白，以抗H5N1-HA兔源多克隆抗體(1∶2 000)為一抗，羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，檢測HA 蛋白的表達。同時，將2 μg pCS-H5HA 分別轉(zhuǎn)染 293T 細胞 和 Atg3 敲除293T 細胞，轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞，提取細胞可溶性總蛋白，以上述同樣方法檢測HA 蛋白，分析巨自噬途徑被抑制后HA 蛋白的表達變化。

1.7 溶酶體降解HA 蛋白形成的凝集結(jié)構(gòu)的檢測將 1 μg pCS-H5HA 和 1 μg 重組質(zhì)粒 GFP-250 共轉(zhuǎn)染293T 細胞[15]，轉(zhuǎn)染后20 h 向細胞加入終濃度為100 nmol/L 的Baf-A1，48 h 后利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光，即為凝集結(jié)構(gòu)。每個樣品隨機選取不同區(qū)域，拍攝15 張圖片，利用軟件ImageJ 定量分析綠色熒光。

1.8 統(tǒng)計學分析 所有實驗數(shù)據(jù)在Graphad prism 6.0 軟件中進行配對雙尾t 檢驗統(tǒng)計學分析，其中每組平均值的標準誤差(SD)在圖例中均以誤差線表示，其中*：p＜0.05，表示差異顯著；**：p＜0.01、***：p＜0.001、****：p＜0.0001，表示差異極顯著；ns：p≥0.05，表示無顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 HA 蛋白誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的檢測結(jié)果 利用pCS-H5HA 與pXBP1u-Luc 按照常規(guī)方法共轉(zhuǎn)染細胞后加入螢光素酶檢測底物，利用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性，結(jié)果顯示在293T 細胞中，與空載體轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCS-H5HA 的細胞的熒光素酶活性明顯升高(圖1)，表明過表達HA 蛋白可顯著增強Xbp1 的剪切，提示部分HA 蛋白由于錯誤折疊而誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。

2.2 HA 蛋白溶酶體降解途徑的檢測結(jié)果 將過表達HA 蛋白的細胞利用溶酶體降解抑制劑Baf-A1 處理，檢測HA 的表達水平是否恢復。Western blot 結(jié)果顯示，當加入溶酶體抑制劑Baf-A1 后，HA 蛋白表達量與DMSO 組相比極顯著增加(p＜0.001) (圖2)，表明Baf-A1 能夠顯著上調(diào)HA 的表達水平，提示部分HA 經(jīng)由溶酶體途徑降解。

2.3 CMA 途徑降解HA 蛋白的檢測結(jié)果 利用western blot 檢測3 條siRNA 干擾效率，結(jié)果顯示編號為 1283 的 siRNA 的干擾效果最好(圖3A、3B)。將 293T 細胞轉(zhuǎn)染 Lamp2a siRNA-1283 和 pCS-H5HA后，western blot 檢測HA 蛋白表達量，結(jié)果顯示干擾Lamp2a 表達細胞中的HA 蛋白的表達量與對照組細胞相比無明顯變化(p＞0.05) (圖3C、3D)，表明HA 蛋白并未通過CMA 途徑降解。

2.4 內(nèi)吞途徑降解HA 蛋白的檢測結(jié)果 利用ELISA 檢測不同時間點細胞膜表面HA 蛋白數(shù)量變化，以已被證實通過細胞內(nèi)吞途徑降解的PRV 囊膜糖蛋白gE[14]用作本試驗的陽性對照。結(jié)果顯示當細胞被置于37 ℃45 min 后，細胞膜表面gE 蛋白與轉(zhuǎn)染起始點時相比明顯降低，而HA 蛋白則無明顯變化(圖4)，表明內(nèi)吞途徑并未參與HA 蛋白降解。

2.5 自噬通路降解HA 蛋白的檢測結(jié)果 293T 細胞轉(zhuǎn)染pCS-H5HA 后，用自噬抑制劑Wortmannin 處理細胞，western blot 檢測HA 蛋白表達水平。結(jié)果顯示，當自噬被抑制后(表現(xiàn)為LC3-Ⅱ的降解受到抑制)，HA 蛋白表達量并無明顯變化(圖5A、5B)，表明自噬途徑并未參與HA 蛋白的降解。為了進一步驗證該結(jié)論，利用自噬相關(guān)分子Atg3 基因敲除細胞系，檢測HA 蛋白的表達。結(jié)果顯示HA 蛋白在Atg3 敲除細胞中的表達量與野生型293T 細胞相比并無明顯差異(圖5C、5D)。以上結(jié)果表明HA 蛋白并未通過自噬途徑降解。

2.6 凝集的HA 蛋白通過溶酶體降解檢測結(jié)果pCS-H5HA 與 GFP-250 共轉(zhuǎn)染細胞，BAF-A1 處理細胞后，觀察細胞中綠色熒光，并做定量分析。結(jié)果顯示，HA 蛋白在293T 細胞中可形成凝集結(jié)構(gòu)，且溶酶體抑制劑Baf-A1 可增加細胞凝集HA 的數(shù)量(圖6)。表明HA 蛋白在細胞內(nèi)表達時，部分可溶的HA 蛋白首先發(fā)生凝集，隨后凝集的HA 通過溶酶體降解。

3 討 論

A 型流感病毒是自然界中最常見的流感病毒，可以造成世界范圍內(nèi)的大流行。目前應對流感病毒感染的方法主要是疫苗接種和藥物治療。商品化的抗流感病毒藥物主要有NA 抑制劑藥物奧司他韋和扎那米韋以及M2 抑制劑藥物金剛烷胺和金剛乙胺[16]，但這些抗病毒藥物會促使產(chǎn)生出大量耐藥病毒株。因此，有必要開發(fā)新的抗病毒手段。HA 蛋白是流感病毒啟動感染、致病性和傳染性的主要決定組分[5-6,8]。HA 蛋白的成熟對于流感病毒的感染有著至關(guān)重要的作用[7]。糖蛋白的加工成熟是一個易于出錯的過程，而折疊錯誤的蛋白質(zhì)不具備正常的生物學功能[9]，其在細胞中不斷累積會對細胞產(chǎn)生一定的刺激和毒性。細胞為維持穩(wěn)態(tài)則會利用蛋白降解通路降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)[11]。

為了探究HA 蛋白通過溶酶體降解的具體機制，本研究首先利用溶酶體抑制劑Baf-A1 處理表達HA蛋白的細胞，發(fā)現(xiàn)HA 蛋白的確可通過溶酶體途徑降解。通過對溶酶體不同降解途徑的分析，發(fā)現(xiàn)HA 蛋白并未通過CMA、內(nèi)吞和自噬途徑降解，而是HA 蛋白在其表達過程中，不正確折疊的HA 不斷聚集，最終形成了一種疏水的致密性結(jié)構(gòu)，即為凝集的HA，該凝集結(jié)構(gòu)可被溶酶體所降解。研究表明多種病毒感染后均可以誘導細胞產(chǎn)生凝集結(jié)構(gòu)，凝集結(jié)構(gòu)對于病毒的組裝以及病毒蛋白的降解等方面均發(fā)揮著作用[17-19]。有研究報道流感病毒可以劫持凝集結(jié)構(gòu)的形成機制從而利于自身病毒的侵入[20]。本研究發(fā)現(xiàn)HA 蛋白能夠形成凝集結(jié)構(gòu)并通過溶酶體降解，這有可能是宿主細胞為了對抗流感病毒，通過降解病毒相關(guān)蛋白以抑制病毒的復制，此推測需要進一步的深入研究。本研究雖然證明部分HA 蛋白通過溶酶體降解，但對于其具體機制，特別是HA 蛋白形成凝集結(jié)構(gòu)后是如何被溶酶體所降解的，目前仍不清楚，而在這個過程中宿主細胞內(nèi)又有哪些分子參與其中，尚需進一步探究。本研究結(jié)果為新型抗流感病毒藥物的研發(fā)奠定了基礎。