宋祥軍，蔣胡艷，侯曼曼，涂 健，邵 穎，劉紅梅，祁克宗

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230036)

禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichia coli，APEC)屬于腸道外致病性大腸桿菌，能引起禽類局部或全身性感染，易與其它疾病并發(fā)，造成混合型感染。APEC 幾乎遍布全國各地，嚴重影響了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失，同時也給人類健康造成嚴重威脅[1]。目前已知的APEC 的毒力因子有耶爾森強毒力島(HPI)、鞭毛毒素、脂多糖、黏附素、外膜蛋白等。在APEC 眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中，二元調(diào)控系統(tǒng)是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中的重要毒力調(diào)控單元，有研究發(fā)現(xiàn)PhoP/Q 參與調(diào)控外膜蛋白合成相關(guān)基因的表達[2-3]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，APEC 中PhoP/Q 的缺失會引起其外膜蛋白編碼基因ompT表達量顯著下調(diào)[4]。

外膜蛋白酶T(Outer-membrane protease T，OmpT)是革蘭氏陰性菌中的一種外膜蛋白酶，屬于Omptins 家族，位于細胞表面，兼具天冬氨酸酶和絲氨酸蛋白酶活性，可通過加工或者降解多種宿主蛋白質(zhì)使宿主發(fā)病[5]。Hejair 等人研究發(fā)現(xiàn)OmpT 的缺失使得APEC 毒力、侵襲力及黏附力均下降[6]。Cheng 等人通過研究發(fā)現(xiàn)OmpT 能夠抵抗尿陽離子抗菌肽的抗菌活性，促進細菌在泌尿道定植[7]。Stumpe 等人報道，OmpT 可作為一種胞質(zhì)外蛋白酶，使富含低分子精氨酸的核蛋白的抗菌肽魚精蛋白失活[8]。陳娟通過熒光定量PCR 方法檢測發(fā)現(xiàn)缺失ompT基因的APEC 菌株中I 型菌毛合成必需蛋白基因FimC表達量下調(diào)，推測ompT基因通過影響菌株黏附的能力來改變APEC 的致病力[9]。但關(guān)于OmpT對APEC 生物學(xué)特性及致病性影響的機理研究甚少。

本實驗通過構(gòu)建ompT基因缺失株及回復(fù)株，檢測OmpT 蛋白對APEC 生物學(xué)特性和致病性的影響，并通過mRNA 測序?qū)mpT基因的缺失是否會影響其它基因的表達進行分析，為進一步研究APEC 對家禽的感染奠定一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 APEC AE17 株、AE17-pKD46、pKD3、pCP20、質(zhì)粒pSTV-28、雞巨噬細胞HD-11均為本實驗室保存；DH5α 感受態(tài)細胞、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；1日齡雛雞購自安徽省安禽養(yǎng)殖公司。

1.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 中登錄的APEC O1型ompT基因序列(CP000468.1)，利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 用于基因敲除和回復(fù)的引物序列引物名稱Primer AE17-F AE17-R ompT-in-F ompT-in-R ompT-pKD3-F引物序列(5'-3')Sequence (5'-3')GAGCGATCTTGGCTATACC GTGAAGCTATCTAACAACGG GCTCCTCAACGAACCCAAT TCATCTCTGAATCCCTCCTCA ATGCGGGCGAAACTTCTGGGAATAG TCCTGACACCCCCTATGTAGGCTGG AGCTGCTT TTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGCA GTAGTGATGAAGTTACATATGAATA TCCTCCTTAGTTC CAAGAATTGTGGCTCCGTAT AGATCGCCTCGCTGTTAG GATACCGTCCGTTCTTTCCTT TGATGATACCGCTGCCTTACT TTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACC GTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCC CAGGAAACAGCTATGAC GTTTTCCCAGTCACGAC CCGGAATTCCGGATGCGGGCGAAA CTTCTGGGAA CCCAAGCTTGGGTTAAAAGGTGTA CTTAAGACCA大小/bp Size/bp 1 023 bp 120 bp 1 013 bp ompT-pKD3-R ompT-out-F ompT-out-R pKD46-F pKD46-R pCP20-F pCP20-R M13-F M13-R ompT-EcoRⅠ-F 2 427 bp 888 bp 409 bp 123 bp 978 bp ompT-Hind Ⅲ-R

1.3ompT缺失株的構(gòu)建 以pKD3 為模板，以ompT-pKD3-F/R 為引物擴增ompT-pKD3 抗性片段，電轉(zhuǎn)化至AE17-pKD46 感受態(tài)細胞中，于含氯霉素的LB 平板上挑取陽性單菌落，利用ompT-out-F/R引物對其進行PCR 驗證，將驗證正確的陽性重組子接種于含氯霉素抗性的培養(yǎng)液中，42 ℃200 r/min過夜培養(yǎng)消除pKD46 后將陽性重組子制備感受態(tài)細胞。將pCP20 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細胞，涂布于含氯霉素和氨芐青霉素的平板中進行篩選，將篩選獲得的重組子利用ompT-in-F/R，pKD3-F/R、ompT-out-F/R 引物進行PCR 驗證，將驗證正確的ompT基因缺失菌株命名為ΔompT。

1.4 回復(fù)株ΔompT-comp 的構(gòu)建 利用常規(guī)方法提取APEC AE17 菌株基因組為模板，以含有EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位點的ompT-EcoRⅠ-F/ompT-Hind Ⅲ-R 為引物擴增并回收純化片段EcoRⅠ-ompT-Hind Ⅲ，連接至pSTV-28 質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，涂布于含氯霉素抗性的LB 平板，挑取陽性單菌落利用M13-F/R 和ompT-in-F/R 引物進行鑒定，將鑒定正確的陽性質(zhì)粒命名為pSTV-28-ompT，并將其電轉(zhuǎn)化ΔompT，利用M13-F/R 和ompT-out-F/R 兩對引物對其進行鑒定，將驗證正確的菌株命名為ΔompT-comp。

1.5 AE17、ΔompT以及 ΔompT-comp 生長曲線及運動性的測定 分別挑取 AE17、ΔompT以及ΔompT-comp 單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期再次進行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，每隔1 h 測定各自O(shè)D600nm值，根據(jù) OD600nm值繪制生長曲線。當 AE17、ΔompT和 ΔompT-comp OD600nm=1.0 時，各取 10 μL菌液于半固體培養(yǎng)基中，9 h 后利用游標卡尺測量菌圈大小，進行各菌株的運動性試驗。

1.6 雞巨噬細胞吞噬試驗 接種雞巨噬細胞HD-11于12 孔細胞培養(yǎng)板，滴加DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，每孔滴加2×107cfu 細菌(細菌∶細胞=100∶1)，使其與雞巨噬細胞充分作用，然后PBS 洗3 次，去除未被雞巨噬細胞吞噬的菌體。向 12 孔板中加入含慶大霉素(100 μg/mL)的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)1.5 h，再次棄去，PBS 洗3 次，加入1 mL 0.1 % TritonX-100 裂解細胞釋放胞內(nèi)細菌后，10 倍稀釋涂于平板上，以平板計數(shù)法計算細菌數(shù)量。

1.7 細菌半數(shù)致死量(LD50)的測定 將 AE17、ΔompT及 ΔompT-comp 分別轉(zhuǎn)接于 LB 固體平板，挑取單菌落培養(yǎng)至對數(shù)期，PBS 清洗后每株菌液分別稀釋至 6 個濃度梯度：1×108cfu/mL、1×107cfu/mL、1×106cfu/mL、1×105cfu/mL、1×104cfu/mL、1×103cfu/mL。將7日齡雛雞隨機分為19 組，每組8 只，并將3 株菌分別通過大腿肌肉注射1 mL 進行感染試驗，對照組注射等量PBS。連續(xù)觀察7 d，記錄死亡雛雞的數(shù)量。根據(jù)寇氏法計算上述3 株菌的LD50。

1.8 組織載菌量試驗 分別挑取上述3 株菌于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)期，PBS 稀釋至1×106cfu/mL，將3 株菌分別通過大腿肌肉注射的方式感染7日齡雛雞，每只1 mL，每組8 只，感染24 h 后迫殺，無菌采集肝臟、脾臟和肺臟組織，滅菌PBS 研磨后10 倍梯度稀釋，利用平板計數(shù)法計算細菌數(shù)量。

1.9 AE17 及 ΔompT樣品的 RNA-Seq 測序 分別將AE17 及ΔompT培養(yǎng)至OD600nm=1.5，離心后棄上清收集菌體。將所收集的菌體用PBS 清洗后置于-80 ℃冷凍保存，樣品由上海伯豪公司進行RNASeq 測序。以差異倍數(shù)(Fold change)絕對值≤2 且q-value≤0.05 作為篩選差異基因的標準。對所獲取的差異表達基因進行GO 及KEGG 分析。選取8 個差異基因，以dnaE作為內(nèi)參基因通過熒光定量PCR 驗證RNA-Seq 的結(jié)果，引物見表2。

表2 熒光定量的引物序列基因名稱Gene name fliY產(chǎn)物長度/bp Product size (bp)138 ompF 125 ibeT 108 aphA 156 motB 99 rfaQ 114 cheA 194 irp2138 dnaE引物序列(5'-3')Sequence (5'-3')F: CGGTTACTGCCAGCGTATCGTTG R: GCGTGGATGTGCGTACCTATGATG F: TTCGCTGCCAGGTAGATGTTGTTC R: GGTGCTTATGGTGCCGCTGAC F: GTCTGTTACCGCTACTGCCTATGC R: ATCCAACCAATACGGCCACGAAC F: TTCCTGCCACCAACATGAATCCG R: GGATACCACGAGCGCCAACATC F: GGCGCTTACTGGCTCATTCTGG R: GCCGTCAACCGTCGCATCAG F: CAACACCTGCATGATCAAGTTCGC R: ACTTATCCGTGCTGACGCCATTG F: GCTACACGGATGCTGGTGGATTC R: ATCGCCGAAGATGACATCACTGC F: GTCGGTGTGGTCAACGGTTCTC R: CTCAGCAGCATCAGCGAGGTG F: GATTGAGCGTTATGTCGGAGGC R: GCCCCGCAGCCGTGAT 80

1.10 統(tǒng)計分析 實驗所涉及到的數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 軟件進行單因素分析，其結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，p＜0.01 為差異極顯著，p＜0.05 為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ompT缺失株和回復(fù)株的鑒定 通過ompT外側(cè)引物ompT-out-F/R 對野生株及缺失株進行PCR 鑒定，結(jié)果顯示，對照組野生菌株擴增片段約為2 500 bp，ompT基因缺失株擴增片段約為1 500 bp，與預(yù)期相符(圖1A)，表明正確構(gòu)建缺失株ΔompT。利用 M13-F/R、ompT-out-F/R、ompT-in-F/R 引物對回復(fù)菌株進行鑒定，結(jié)果顯示所擴增片段分別約為1 000 bp、1 500 bp、120 bp，與預(yù)期相符(圖1B)，表明回復(fù)株ΔompT-comp 正確構(gòu)建。

2.2 生長曲線和運動性測定 對AE17、ΔompT和ΔompT-comp 菌株培養(yǎng)后測定各時間點菌液OD600nm值，并繪制生長曲線定，結(jié)果顯示3 株菌生長曲線基本一致(圖2A)，表明ompT的缺失不影響APEC的增殖特性。測量 AE17、ΔompT和 ΔompT-comp菌圈大小，結(jié)果顯示3 株菌的運動直徑分別為345±3 mm、330±5 mm、355±3mm，統(tǒng)計學(xué)分析顯示三者差異不顯著(p＞0.05) (圖2B，2C)，表明ompT基因缺失后APEC 的運動性并未受到影響。

2.3 雞巨噬細胞吞噬試驗結(jié)果 通過平板計數(shù)法檢測裂解的巨噬細胞釋放細菌數(shù)量，結(jié)果顯示1.5 h后 HD-11 細胞吞噬 AE17、ΔompT、ΔompT-comp 的細菌量分別為：(4.33±0.21)× 106cfu、(4.27±0.18)×106cfu、(4.57±0.16)×106cfu (圖3)，統(tǒng)計學(xué)分析顯示三者差異不顯著(p＞0.05)。表明ompT基因的缺失不影響APEC 對HD-11 細胞的抗吞噬能力。

2.4 細菌LD50的測定結(jié)果 采用寇氏法對3 株菌感染雛雞后的結(jié)果進行統(tǒng)計并計算，結(jié)果顯示AE17、ΔompT和 ΔompT-comp 菌株感染組的 LD50分別為 7.499×104cfu、7.499×105cfu 和 3.162×105cfu，與野生株相比，ompT基因的缺失導(dǎo)致其對雛雞LD50增加10 倍。表明ompT基因缺失導(dǎo)致 APEC 致病力降低。

2.5 組織載菌量試驗結(jié)果 相同劑量的3 株菌感染雛雞后對試驗雞各臟器組織載菌量進行檢測，結(jié)果顯示 AE17、ΔompT及 ΔompT- comp 感染雛雞肺臟組織載菌量分別是107.18cfu/g、105.66cfu/g、106.88cfu/g(p＜0.01)；肝臟組織載菌量分別是 108.08cfu/g、105.22cfu/g、106.94cfu/g(p＜0.01)、脾臟組織載菌量分別是108.07cfu/g、106.49cfu/g、108.09cfu/g (p＜0.01) (圖4)。表明ompT基因缺失導(dǎo)致APEC 在肝臟、脾臟、肺臟組織中的定植力降低。

2.6ompT缺失對APEC 基因轉(zhuǎn)錄的影響 分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示篩選得到490 個差異表達基因，其中365 個基因表達上調(diào)，125 個基因表達下調(diào)(圖5A)。GO 分析結(jié)果顯示，差異表達基因主要富集在裂解酶活性、鐵離子穩(wěn)態(tài)、肽聚糖生物合成、細胞形態(tài)調(diào)控等生物學(xué)過程(圖5B)。KEGG 通路分析結(jié)果顯示，差異基因主要富集在細菌趨化性、生物膜形成、脂多糖生物合成等通路(圖5C)。選取部分差異表達基因進行熒光定量PCR 驗證，結(jié)果與RNA-Seq 測序結(jié)果一致(圖6)。以上結(jié)果表明OmpT蛋白參與細菌的一些重要通路的調(diào)控。

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)細菌的外膜蛋白參與細菌對宿主致病性的調(diào)控，OmpT 蛋白在細菌對宿主的致病性中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于OmpT 對APEC 的作用研究甚少。因此本研究通過構(gòu)建ompT的缺失株及回復(fù)株，探究OmpT 對APEC 生物學(xué)特性及致病性的影響。

生物學(xué)試驗結(jié)果顯示，野生株AE17 與缺失株ΔompT的生長速率差異不顯著，與何洪波實驗結(jié)果[10]一致，表明ompT基因缺失對APEC 的生長速率無影響。在細菌運動性試驗中，ompT基因的缺失不影響APEC 的運動性，這可能是由于ompT基因的缺失并不影響菌株鞭毛的運動性。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)ompT基因缺失后，與鞭毛相關(guān)的基因flgA、flgK、flhD、flhE、fliY、ycgR表達量上調(diào)，僅fliK表達量下調(diào)。FlgK 屬于鞭毛中的連接蛋白，起到連接鞭毛絲和基體的作用，F(xiàn)lhD 的表達量決定著鞭毛生成的數(shù)量，F(xiàn)liY 為鞭毛馬達開關(guān)蛋白，F(xiàn)liK 為鞭毛鉤長度控制蛋白，YcgR 屬于鞭毛制動蛋白，可與鞭毛蛋白相互作用影響鞭毛的運動速率，而運動性試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生株與缺失株的運動性差異并不顯著，推測可能是多個鞭毛相關(guān)差異表達基因相互作用的結(jié)果。

組織細菌載量試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)ompT基因缺失后雛雞肝臟、脾臟、肺臟的載菌量下降，與周亞菲實驗結(jié)果一致[11]，表明ompT的缺失可使細菌對組織的定植力下降。ompT基因缺失后，脂多糖生物合成通路中kpsU、lpxK基因的表達量顯著下調(diào)。kpsU屬于莢膜多糖合成基因簇kps中的基因，莢膜多糖是細菌發(fā)揮毒力的主要因素，能夠保護細菌免受宿主先天性免疫系統(tǒng)的清除，同時可通過多種機制提高致病菌的毒力，莢膜多糖的存在有助于病原菌在宿主中的定植[12]。lpxK是合成LPS 中類脂A 的重要基因，脂多糖(LPS)是大腸桿菌外膜的重要組成部分。有研究表明LPS 的結(jié)構(gòu)對細胞粘附性、細胞外膜通透性、菌膜形成方面起到重要作用[13]。推測kpsU及l(fā)pxK基因表達量的下調(diào)可能是組織載菌量下降的原因之一。

LD50檢測試驗發(fā)現(xiàn)ompT缺失株的LD50高于野生株AE17，提示ompT基因的缺失導(dǎo)致APEC 的致病力下降。對ompT缺失株差異表達基因進行KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因富集在多個毒力相關(guān)信號通路中，包括糖酵解通路、生物膜形成通路、ABC 轉(zhuǎn)運等通路。糖酵解通路是細菌獲取能量的主要途徑，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示富集在糖酵解通路中的差異表達基因均下調(diào)。推測這些基因的下調(diào)導(dǎo)致細菌能量減少，導(dǎo)致缺失株的致病力降低。有7個差異表達基因富集在生物膜形成通路中，其中6個差異表達基因下調(diào)，生物膜是細菌生長過程中分泌于胞外的成分，參與細菌應(yīng)對不利環(huán)境[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)ABC 轉(zhuǎn)運通路中proW、proV、proX、lolD表達量均下調(diào)，ABC 轉(zhuǎn)運蛋白是一類在原核及真核生物中均廣泛分布的、具有多種功能的膜蛋白超家族，proVWX 為ABC 轉(zhuǎn)運通路中的攝入系統(tǒng)，是大腸桿菌獲取營養(yǎng)的主要途徑之一，proW、proV、proX的表達下調(diào)可導(dǎo)致APEC 從外界獲取的營養(yǎng)物質(zhì)減少。另外，LolCED 屬于ABC 轉(zhuǎn)運通路中的輸出系統(tǒng)，有研究表明將大腸桿菌暴露于LolCED 抑制劑中，可使LolCED 功能減弱，最終導(dǎo)致細胞活性喪失，細胞裂解[15]。在本實驗中糖酵解通路、生物膜形成通路、ABC 轉(zhuǎn)運通路中相關(guān)基因表達量的下調(diào)可能是缺失株致病力下降的原因。

本實驗初步研究了APECompT基因缺失后對其生物學(xué)特性及致病性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ompT的缺失未對APEC 生物學(xué)特性造成影響，但導(dǎo)致APEC的致病力下降。通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，OmpT 是通過影響多個信號通路基因的表達導(dǎo)致影響APEC 的致病力。本研究為APEC 致病機理研究提供了參考依據(jù)。