趙 威 徐豪芒 鄭建波 賈永義 顧志敏 羅 琛

(1. 浙江大學生命科學學院, 杭州 310058; 2. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313001)

成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor, FGFRs)是一類能將FGF信號傳遞到細胞質(zhì)中的跨膜酪氨酸激酶受體。它們通過調(diào)控細胞的增殖、分化、遷移和凋亡[1]而在血管形成[2,3]、骨骼發(fā)育[4—8]、組織損傷修復和愈合[9,10]以及腫瘤發(fā)生[11,12]等過程中起重要作用。目前研究最深入的FGFRs因子包括Fgfr1、Fgfr2、Fgfr3和Fgfr4。它們都包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個部分。胞外區(qū)為配體識別和結(jié)合區(qū), 其中有3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Ig-Ⅰ、Ig-Ⅱ和Ig-Ⅲ), 跨膜區(qū)為穿過細胞膜的疏水性螺旋區(qū)段, 細胞內(nèi)區(qū)為酪氨酸激酶區(qū)[13]。FGFR通過輔助因子硫酸乙酰肝素(Heparansulfate, HS)的介導[14,15], 與配體FGF結(jié)合來啟動FGFRs胞內(nèi)酪氨酸磷酸化。然后, 可激活不同胞內(nèi)信號通路的激酶, 如促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogenactivated protein kinase, MAPK), 磷脂酰肌醇3-激酶-Akt [Phosphoinositide 3-kinase(PI3K)-AKT,PI3K-Akt]和磷脂酶Cγ/Ca2+(Phospholipase Cγ/Ca2+,PLCγ/Ca2+)[16,17]等, 而產(chǎn)生多種不同的生物學效應。近年來發(fā)現(xiàn)了1種FGFR受體類似物Fgfrl1。這種類FGFR受體缺乏胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域, 能與FGFs結(jié)合但不能介導FGF信號。因此, 能與其他FGFR受體競爭結(jié)合FGF配體而起抑制FGF信號的作用[18]。

近年對鯉(Cyprinus carpio)基因組序列進行的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)了一個成纖維細胞生長因子受體同源類似物1(fibroblast growth factor receptor homolog 1-like,fgfrhl-1, XM_016294026.1)序列。該fgfrhl-1的基因組序列與鯉的其他fgfr基因組序列差異顯著。但根據(jù)編碼區(qū)堿基序列預測的蛋白結(jié)構(gòu)與典型的FGFR家族成員結(jié)構(gòu)類似, 也具有胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)以及胞外配體識別結(jié)合區(qū), 但Fgfrhl-1的胞外區(qū)缺失3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。隨后在斑馬魚、金魚、紅肚水虎等魚類基因組中也發(fā)現(xiàn)了fgfrhl-1序列。有趣的是不同魚類中fgfrhl-1的基因組序列高度保守, 但在魚類以外的其他脊椎動物物種基因組中尚未發(fā)現(xiàn)其同源基因組序列。fgfrhl-1在魚類中的這種獨特性和進化保守性, 提示其可能在魚類中具有某種獨特而重要的生物學功能。但目前尚無有關(guān)fgfrhl-1基因克隆和表達分析證明其是功能基因的研究報道。因此, 我們選擇在親緣關(guān)系較遠的草魚(Ctenopharyngodon idellus)和翹嘴鲌(Culter alburnusBasilewsky)中克隆了fgfrhl-1的cDNA, 并通過半定量RT-PCR和冰凍切片原位雜交分析了該基因在成體草魚和翹嘴鲌多種組織中的表達情況, 以為深入研究fgfrhl-1在魚類中的功能和判斷其育種價值提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本研究所用的成年草魚購自杭州三墩鎮(zhèn)溫州村菜市場, 翹嘴鲌取自湖州淡水研究所養(yǎng)殖基地。適量的活體草魚肌肉、肌間隔、肝臟、脾、心臟、鰓、尾鰭和翹嘴鲌肌肉、肌間隔、肝臟、腎、腦、脾、心臟、尾鰭組織等樣品分別于液氮中快速冷凍處理后, 保存在-80 ℃冰箱, 用于后續(xù)RNA和基因組DNA提取。肌間隔的結(jié)締組織呈白色, 容易在體視顯微鏡下與肌肉纖維剝離。其他組織和器官的結(jié)締組織與間質(zhì)組織不容易分離, 因此未分開取樣。Ex-Taq酶、pMD18-T克隆載體試劑盒購自TaKaRa 公司, Total RNA Extractor試劑盒購自生工生物工程股份有限公司, TURBO DNA free kit試劑盒購自ambion公司, HiFiScript cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自康為公司, SMARTerTMRACE試劑盒購自ClonTech公司, 膠回收試劑盒購自Axygen公司, DIG RNA Labeling Mix購自Roche公司, 實驗中所用引物皆委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 Total RNA的提取及cDNA第一鏈合成

基因組DNA使用酚氯仿法從草魚和翹嘴鲌尾鰭組織中提取。各組織Total RNA按照Total RNA Extractor試劑盒說明書步驟提取。為避免基因組DNA污染, 所提取的Total RNA都使用TURBO DNA free kit試劑盒進行消化處理。最后將提取的所有核酸產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳檢測和濃度測定, 選擇無污染的核酸產(chǎn)物用于后續(xù)實驗。以提取的Total RNA為模板, 使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA的第一條鏈。具體操作按照試劑盒說明書步驟進行。

表1 用于草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1基因克隆、表達分析的引物Tab. 1 Primers used for cloning and expression of fgfrhl-1 in Ctenopharyngodon idellus and Culter alburnus

1.3 全長fgfrhl-1 cDNA的克隆

通過比較GenBank中預測的多種鯉科魚類fgfrhl-1 mRNA序列, 篩選出保守序列, 再根據(jù)該序列設計引物fgfrhl-S1和fgfrhl-AS1 (表 1)。PCR的反應體系為50 μL, 成分包含10×Ex-TaqBuffer 5 μL、dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL、正反向引物(2.5 μmol/L)各4 μL、cDNA 2.5 μL,Ex-Taq0.5 μL及補足ddH2O至50 μL。擴增條件: 預變性94 ℃, 5min; 變性94 ℃, 30s, 退火50 ℃, 30s, 延伸72 ℃, 60s(32個循環(huán)); 延伸7min結(jié)束反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接至pMD18-T克隆載體送上海生工測序, 測序結(jié)果使用NCBI網(wǎng)站中的Blast功能進行序列比對后確認其為目的片段。然后根據(jù)已獲得編碼區(qū)序列分別設計正反向特異性巢式引物c/e-5′RACEAS1、c/e-5′RACEAS2和c/e-3′RACES1, c/e-3′RACES2 (表 1),其中c表示草魚RACE引物, e表示翹嘴鲌RACE引物。參照SMARTerTMRACE試劑盒的說明書進行cDNA末端擴增。最終獲得草魚和翹嘴鲌fhfrhl-1基因的cDNA全長。再根據(jù)cDNA全長在5′端上游和3′端下游分別設計引物c/e-LS-S1和c/e-LS-AS1 (表 1)進行連鎖分析。最終將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)Blast序列對比來確定所得到的草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1全長cDNA序列的正確性。

1.4 氨基酸序列預測、比對及進化樹分析

使用Primer Premier 5軟件推測出草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1基因編碼的氨基酸序列, 用DNAMAN軟件將推測的氨基酸序列結(jié)果比對進行同源性分析,隨后使用MEGA 7.0軟件的Neighbor-joining方法構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。利用在線軟件SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)進行了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測。

1.5 fgfrhl-1在草魚和翹嘴鲌成體不同組織和器官中表達分析

測定所提草魚和翹嘴鲌RNA的濃度, 各組織取1 μg Total RNA為模板, 使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用Jellyfish軟件比對草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1編碼區(qū)序列(CDS), 發(fā)現(xiàn)兩者CDS十分保守, 只需設計一對跨內(nèi)含子引物semi-S1, semi-AS1 (表 1)來做兩者半定量PCR?？鐑?nèi)含子引物參考斑馬魚fgfrhl-1基因內(nèi)含子結(jié)構(gòu)位置設計。半定量PCR內(nèi)參基因用β-actin基因, 引物序列為β-actinS: 5′-TCACACCTTCTACAACGAG CTGCG-3′,β-actinAS: 5′-GAAGCTGTAGCC TCTCTCGGTCAG-3′, 取逆轉(zhuǎn)錄cDNA各1 μL為模板。反應體系為10 μL: 2×Ex-Taqmix 5 μL, semi-s1 1 μL, semi-as1 1 μL, cDNA 1 μL, 水2 μL。循環(huán)參數(shù)為95℃ 1min; 98℃ 10s, 55℃ 30s, 72℃ 30s (3個循環(huán)); 98℃ 10s, 53℃ 30s, 72℃ 30s (32個循環(huán)); 72℃7min。

根據(jù)草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1 cDNA中的CDS序列, 設計合成原位雜交探針所需要的引物probe-S1,probe-AS1 (表 1)。以草魚和翹嘴鲌肌間隔組織cDNA為模板進行PCR, 將900 bp的目的片段與pBluescriptⅡ SK(+/-)質(zhì)粒連接構(gòu)建重組載體并測序。然后合成地高辛標記的反義和正義探針(陰性對照探針), 具體操作按照Roche公司DIG RNA Labeling Mix說明書進行。取新鮮成年活體草魚和翹嘴鲌小塊肌肉、肝臟和脾臟組織進行冰凍切片, 切片厚度12 μm。原位雜交步驟參照本實驗室冰凍切片原位雜交說明書進行, 在實驗過程中做了適當?shù)男薷?。過程包含: 4%的多聚甲醛(PFA)固定切片30min, DEPC處理過的磷酸緩沖液(DEPC-PBS)復水后蛋白酶K消化15min, PBS漂洗后用三乙醇胺(TEA)對切片組織酸化處理, 室溫預雜交2h后用含地高辛標記探針的雜交液55 ℃雜交12—16h。檸檬酸鈉緩沖液漂洗切片后用含羊血清的封閉液室溫封閉2h, 隨后用含抗地高辛抗體的封閉液4℃過夜孵育切片組織。洗脫抗體后, 在顯色液NBT/BCIP作用下, 3—12h后觀察原位雜交信號。

2 結(jié)果

2.1 草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1全長cDNA的結(jié)構(gòu)

用fgfrhl-S1和fgfrhl-AS1引物通過RT-PCR方法在草魚和翹嘴鲌肌肉組織RNA中都擴增到了一段長度為700 bp的核苷酸片段。對該序列測序并通過NCBI網(wǎng)站中Blast功能進行序列分析的結(jié)果顯示其都與鯉魚預測fgfrhl-1序列高度同源, 與fgfr的同源序列差異較大。因此, 可以確定所獲得的擴增產(chǎn)物分別為草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1 cDNA的序列片段。

隨后用SMARTerTMRACE試劑盒通過5′-RACE和3′-RACE擴增草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1 cDNA的5′和3′末端序列, 分別在草魚中獲得了長度為976 bp的上游單一產(chǎn)物和長度為795 bp的下游單一產(chǎn)物; 在翹嘴鲌中獲得了長度為741 bp的上游單一產(chǎn)物和長度為958 bp的下游單一產(chǎn)物。通過用特異性引物對5′端上游和3′端下游序列的連鎖分析, 確定了在草魚和翹嘴鲌中所獲得的上、下游序列都是連鎖的fgfrhl-1 cDNA序列。草魚fgfrhl-1 cDNA序列全長為1472 bp, 包含5′-UTR 213 bp、3′-UTR 56 bp和開放閱讀框(ORF)1203 bp, 編碼400個氨基酸; 翹嘴鲌fgfrhl-1 cDNA序列全長為1886 bp, 包含5′-UTR 298 bp、3′-UTR 385 bp和開放閱讀框1203 bp, 編碼400個氨基酸。序列提交至GenBank (登錄號: MH817443和MH817444)。

2.2 草魚和翹嘴鲌Fgfrhl-1氨基酸序列比對和蛋白結(jié)構(gòu)預測

將Primer Premier 5軟件推測出的草魚和翹嘴鲌Fgfrhl-1氨基酸序列運用DNAMAN軟件進行了同源比對分析, 結(jié)果顯示草魚與翹嘴鲌的Fgfrhl-1氨基酸序列同源性為95.5%, 其酪氨酸激酶區(qū)高度保守。利用在線軟件SMART(http://smart.emblheidelberg.de)對草魚和翹嘴鲌Fgfrhl-1的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行了分析。結(jié)果顯示草魚和翹嘴鲌的Fgfrhl-1的蛋白質(zhì)也都具有胞外區(qū)、跨膜螺旋區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)。但兩者胞外區(qū)均只有19個氨基酸, 缺少3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。這說明兩者Fgfrhl-1的胞外區(qū)的受體功能相同, 但與其他FGFR的受體功能顯著不同。

2.3 不同物種fgfrhl-1基因氨基酸聚類分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了根據(jù)基因組序列預測而來的下列不同魚類的Fgfrhl-1氨基酸序列:包括鯉科中的撫仙金線鲃(XP_016149512.1)、安水金線鲃(XP_016335374.1)、斑馬魚(XP_693602.5)和紅肚水虎(XP_017550332.1), 鯡科中的大西洋鯡(XP_012679480.1), 鮭科中的銀大麻哈魚(XP_0203 59383.1)、太平洋帝王鮭(XP_024289814.1)、虹鱒(XP_021478795.1)、大西洋鮭(XP_014019092.1)和紅點鮭(XP_023869192.1), 骨舌魚科中的美麗硬仆骨舌魚(XP_018603961.1), 象鼻魚科中的副長頜魚(XP_023701156.1), 脂鯉科中的墨西哥脂鯉(XP_022537012.1)。利用MEGA 7.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining)對草魚和翹嘴鲌Fgfrhl-1氨基酸序列與其他魚類的Fgfrhl-1氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹(圖 1)。從圖中可以看出, 草魚和翹嘴鲌Fgfrhl-1與金線鲃和斑馬魚Fgfrhl-1的親緣關(guān)系最近,其次是紅肚水虎和大西洋鯡, 與太平洋帝王鮭和虹鱒關(guān)系相對較遠。這種Fgfrhl-1的系統(tǒng)進化關(guān)系與傳統(tǒng)分類中這些物種的親緣關(guān)系基本一致。

2.4 草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1基因在成體組織中的表達

為了檢測fgfrhl-1基因在草魚和翹嘴鲌成體組織中的表達, 我們在參考斑馬魚fgfrhl-1基因內(nèi)含子結(jié)構(gòu)位置后設計了fgfrhl-1基因跨第五內(nèi)含子引物。用草魚和翹嘴鲌基因組DNA為模版進行PCR擴增, 分別獲得900 bp左右和750 bp左右的產(chǎn)物, 而用cDNA作為模板擴增得到的產(chǎn)物長度為200 bp,說明該引物確實是跨草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1基因的第五內(nèi)含子。半定量RT-PCR結(jié)果顯示fgfrhl-1在草魚肌間隔、脾、肝、尾鰭、鰓和心臟中均有表達;在肌肉纖維中難以檢測到表達。翹嘴鲌中的表達情況與草魚中相同。fgfrhl-1在肌間隔、脾、肝、腎、腦和心臟中均有表達, 肌肉纖維中基本不表達(圖 2)。

圖1 采用Neighbor Joining方法構(gòu)建的不同物種Fgfrhl-1蛋白系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Fgfrhl-1 protein generated with Neighbor Joining method

圖2 fgfrhl-1基因在成體草魚和翹嘴鲌不同組織中的表達Fig. 2 The expression level of fgfrhl-1 in various tissues of adult grass carp and C. alburnus

為直觀地證明fgfrhl-1基因在肌肉組織不同結(jié)構(gòu)中的表達差異, 我們?nèi)〔蒴~和翹嘴鲌成體肌肉組織進行了冰凍切片和mRNA原位雜交分析。結(jié)果表明在成年草魚和翹嘴鲌的肌肉組織里, 都只在肌隔中檢測到了fgfrhl-1 mRNA的雜交信號, 在肌肉纖維中沒有可確認的雜交信號(圖 3a、3b)。

鑒于fgfrhl-1基因在肌肉組織的肌隔和肌纖維中存在表達差異, 我們進一步用冰凍切片原位雜交技術(shù)檢測了草魚和翹嘴鲌肝臟和脾臟中該基因是否也存在組織特異性表達。結(jié)果表明在這兩種魚類的肝臟和脾臟中,fgfrhl-1都只在結(jié)締組織結(jié)構(gòu)中表達, 在間質(zhì)細胞組成的結(jié)構(gòu)中沒有表達(圖 4)。

3 討論

本研究利用RT-PCR、RACE等分子克隆方法獲得草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1全長cDNA。草魚和翹嘴鲌fgfrhl-1 cDNA的序列全長分別為1472和1886 bp,5′-UTR分別為213和298 bp, 3′-UTR分別為56和385 bp, 編碼區(qū)都為1203 bp, 編碼400個氨基酸。根據(jù)堿基序列預測的草魚和翹嘴鲌Fgfrhl-1蛋白的氨基酸序列同源性高達95.5%。根據(jù)氨基酸序列預測的Fgfrhl-1蛋白二級結(jié)構(gòu)同經(jīng)典的FGFRs家族蛋白一樣具有胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū), 跨膜的螺旋區(qū)和胞外受體區(qū), 但其胞外區(qū)比FGFRs缺少了3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。用半定量RT-PCR和組織切片原位雜交技術(shù)在草魚和翹嘴鲌的肌間隔、心臟、鰓、肝、脾和尾鰭中均檢測到了fgfrhl-1表達, 在肌肉纖維中都沒有檢測到其表達。組織切片原位雜交在草魚肝臟和脾臟中也檢測到fgfrhl-1在這些器官的結(jié)締組織和導管中表達, 不在間質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)中表達。這些結(jié)果說明: (1)fgfrhl-1的成體組織特異性表達模式在不同魚類中基本一致, (2)fgfrhl-1在魚類各組織和器官的結(jié)締組織和導管中表達, 不在間質(zhì)細胞中表達。因此, 該基因可能在魚類結(jié)締組織及導管分化調(diào)控或功能維持中有獨特作用。

圖3 fgfrhl-1基因在草魚和翹嘴鲌肌肉組織中表達的原位雜交Fig. 3 In situ hybridization of fgfrhl-1 in muscle tissues of grass carp and C. alburnus

圖4 fgfrhl-1基因在草魚和翹嘴鲌肝臟和脾臟中表達的原位雜交Fig. 4 In situ hybridization of fgfrhl-1 in liver and spleen tissues of grass carp and C. alburnus

基因組進化的比較研究發(fā)現(xiàn)在基因擴增和整個基因組加倍后的重復基因進化過程中, 原始多功能基因的重復基因拷貝會通過序列突變以互補的方式分享其原始基因的功能或者產(chǎn)生具有新功能的基因[19,20]。在fgfr基因進化過程中, Fgfrhl-1丟失了胞內(nèi)酪氨酸激酶受體區(qū), 能與FGF配體結(jié)合但不能介導FGF信號。其生物學功能是與其他FGFR受體競爭FGFs配體而起抑制FGF信號傳遞的作用[18]。草魚和翹嘴鲌Fgfrhl-1雖然仍保留了FGFR受體的胞外區(qū), 跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三個基本二級結(jié)構(gòu)域, 但其氨基酸序列與經(jīng)典的FGFRs有顯著差別。尤其在胞外配體識別結(jié)合區(qū), 缺失了典型FGFRs所具有的3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。因此, Fgfrhl-1的配體識別和結(jié)合功能, 以及信號傳導功能都會與典型FGFR受體有差別。Fgfrhl-1的胞外區(qū)如何識別和結(jié)合配體, 以及在信號傳導途徑中起什么作用都有待進一步的研究來回答。

與其他脊椎動物不同, 真骨魚類的肌肉組織中獨有刺狀肌間小骨(Intermuscular bone)。已有的研究認為這種肌間刺是由肌隔結(jié)締組織通過膜性骨化發(fā)育而來的[21,22]。有趣的是, 在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)魚類中獨有的fgfrhl-1基因在成年草魚和翹嘴鲌肌間隔組織中有明顯表達, 在肌肉纖維中不表達。已有的研究證明了FGFR是調(diào)控骨骼發(fā)育的重要因子。在脊椎動物骨骼發(fā)育過程中, 首先是間充質(zhì)細胞分化為前體成骨細胞, 隨后成骨細胞發(fā)育為成熟骨細胞。Fgfr1和Fgfr2能維持間充質(zhì)細胞的多能性而防止細胞衰老[23]。這兩個基因的突變可促進成骨細胞分化和膜內(nèi)成骨過程, 從而導致顱縫提前閉合[24,25], 提示其具有防止骨發(fā)生的作用。Fgfr3則能抑制軟骨形成, 是骨骼發(fā)育的負性調(diào)節(jié)分子。fgfr3基因敲除的小鼠中小鼠骨骼出現(xiàn)過度生長[26]。Fgfrl-1也被證明在魚類中在鰓軟骨發(fā)育調(diào)控中起重要作用[27,28]。Fgfrhl-1是否與這些典型FGFR因子協(xié)同或拮抗而在魚類肌隔結(jié)締組織膜性骨化中起作用需要進一步研究。