周真真 景 斐 魏 可 張建設(shè)

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 舟山 316022)

先天免疫反應(yīng)是脊椎動(dòng)物抵御微生物入侵的第一道防線[1]。當(dāng)脊椎動(dòng)物被病原體感染時(shí), 病原體高度保守的核糖核酸及蛋白分子成分即病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-association molecular patterns, PAMPs)能夠快速被細(xì)胞模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)識(shí)別[2]。目前已有3種細(xì)胞模式識(shí)別受體被分析鑒定, 分別是Toll樣受體(TLRs)、NOD樣受體(NLRs)和RIG-I樣受體(RLRs)[3—7]。PRRs識(shí)別病原體PAMPs, 啟動(dòng)下游一系列信號(hào)傳導(dǎo)通路, 誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。其中, RLRs是包漿中識(shí)別病毒dsRNA的主要受體家族, RLRs (如RIG-I)的表達(dá)受到多種分子的調(diào)節(jié), 包括病毒dsRNA和病毒dsRNA模擬體poly(I:C)等[2]。而且RIG-I的CARDs結(jié)構(gòu)域被E3泛素連接酶TRIM25 (Tripartite motif-containing 25)泛素化而激活, 這對(duì)于RIG-I信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要[8]。

蛋白泛素化是在El泛素激活酶, E2泛素結(jié)合酶以及E3泛素連接酶作用下對(duì)靶蛋白泛素化修飾從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路并激活細(xì)胞內(nèi)先天免疫應(yīng)答, 而E3泛素連接酶由于其特異性識(shí)別靶蛋白, 因此在蛋白泛素化修飾過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[9,10]。E3泛素連接酶在脊椎動(dòng)物中普遍存在, 并且包括HECT結(jié)構(gòu)域家族、U-box結(jié)構(gòu)域家族和RING結(jié)構(gòu)域家族[11,12]。TRIM蛋白屬于E3泛素連接酶的RING結(jié)構(gòu)域家族, 參與多種生物學(xué)過(guò)程, 包括細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和先天免疫反應(yīng)[13,14]。TRIM家族蛋白在結(jié)構(gòu)上從N端到C端包含保守的RING結(jié)構(gòu)域、1—2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域、Coiled-coil結(jié)構(gòu)域, 另外在C末端還有可變的蛋白結(jié)構(gòu)域[15—18]。其中, RING結(jié)構(gòu)域參與鋅原子的結(jié)合并促進(jìn)對(duì)靶蛋白的泛素化, 提高蛋白的穩(wěn)定性[19];B-box結(jié)構(gòu)域?yàn)門RIM蛋白的特征結(jié)構(gòu)域且能提高TRIM蛋白E3泛素連接酶活性[20,21]; Coiled-coil結(jié)構(gòu)域可以促進(jìn)TRIM蛋白間同源或異源的寡聚反應(yīng)[22];C末端的PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域通過(guò)與RIG-I相互作用導(dǎo)致下游抗病毒信號(hào)明顯增加, 從而誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生[23]。TRIM家族在哺乳動(dòng)物中被廣泛研究,TRIM家族基因參與哺乳動(dòng)物機(jī)體多種生命活動(dòng)[13,24],例如, 與HIV-I病毒相關(guān)的TRIM5[25], 神經(jīng)元特異性蛋白TRIM22[26]以及與先天免疫相關(guān)的TRIM25[8]、TRIM15[27]和TRIM21[28]等。

近幾年TRIM家族成員在魚類中被研究, 在斑馬魚(Danio rerio)基因組中發(fā)現(xiàn)240種TRIM家族基因成員或類似TRIM基因[29], 其中包含魚類特有的TRIM亞家族基因 finTRIM/ftr (Fish novel large multigene TRIM gene)。在大西洋鮭(Salmo salar)[30]、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[31]和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[32]等硬骨魚類中發(fā)現(xiàn)病毒和病毒模擬體poly(I:C)誘導(dǎo)TRIM25基因表達(dá), 而且TRIM25基因在體外過(guò)表達(dá)可抑制病毒復(fù)制, 在培養(yǎng)的魚類細(xì)胞中可以增強(qiáng)干擾素信號(hào)基因表達(dá)[32]。這些研究充分表明TRIM25基因可能在硬骨魚類抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

大黃魚(Larimichthys crocea)是我國(guó)一類重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚種[33,34]。近年來(lái), 大黃魚遭受細(xì)菌、寄生蟲和病毒等的危害, 對(duì)大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的影響[35,36]。因此, 為建立控制大黃魚疾病的有效措施, 需要更深入地研究大黃魚抗病分子機(jī)理。為研究大黃魚抗病免疫機(jī)制, 本研究選擇大黃魚TRIM家族中的TRIM25基因進(jìn)行初步研究。因此,本研究對(duì)大黃魚TRIM25基因編碼區(qū)進(jìn)行分子克隆,并研究該基因的分子特征以及在poly(I:C)感染后的表達(dá)分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用大黃魚是來(lái)自中國(guó)浙江省舟山市, 用于實(shí)驗(yàn)的每條大黃魚約重100 g。實(shí)驗(yàn)大黃魚需在25℃水箱中暫養(yǎng)2周左右, 每天至少投喂2次。實(shí)驗(yàn)大黃魚麻醉后被處死, 取頭腎、脾臟、肝臟和外周血等組織, 并將取出的各組織在-80℃凍存。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.2 poly(I：C)的用法

病毒dsRNA模擬體poly(I:C)原液(Sigma-Aldrich)溶解在1 mg/mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)中, 通過(guò)腹腔向大約重100 g的大黃魚體內(nèi)注射0.25 mg poly(I:C), 對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS溶液。在poly(I:C)注射入大黃魚后, 分別在3h、6h、12h、24h和48h時(shí)間點(diǎn)以及注射PBS的對(duì)照組取外周血、頭腎、脾臟和肝臟主要免疫組織, 在-80℃凍存。

1.3 TRIM25基因克隆

采用Trizol試劑(Invitrogen, USA)從凍存的大黃魚各個(gè)組織(-80℃保存)中提取總RNA, 總RNA純度用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 通過(guò)NanoDrop 2000核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)總RNA濃度測(cè)定, RNA樣品OD值一般在1.8—2.1視為純度極高。然后按照SuperScriptTMIII反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen, USA)說(shuō)明書將5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

根據(jù)大黃魚轉(zhuǎn)錄組獲得TRIM25基因編碼序列,針對(duì)TRIM25基因設(shè)計(jì)特異性的引物TRIM25-F/TRIM25-R (表 1), 以大黃魚脾臟cDNA作為模板,用EasyTaq?DNA Polymerase (全式金)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR反應(yīng)體系(20 μL): 上下游引物各0.4 μL, 2.5 mmol/L dNTP Mixture 1.6 μL, 10×EasyTaq?Buffer 2 μL, EasyTaq?DNA Polymerase 0.2 μL, 模板0.4 μL, 加無(wú)菌去離子水15 μL; 設(shè)置PCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s,58℃退火30s, 72℃延伸10s, 32個(gè)循環(huán); 72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠分離, 并利用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根, 中國(guó))進(jìn)行膠回收, 然后連接并克隆到pGEM-T載體上(Promega, USA), 通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得陽(yáng)性克隆子, 送至上海華大基因測(cè)序。最后用DNAstar軟件拼接測(cè)序后的序列, 獲得大黃魚TRIM25基因完整編碼序列, 并命名為L(zhǎng)cTRIM25。

表1 PCR引物信息Tab. 1 PCR primer sequences information

1.4 TRIM25基因生物信息學(xué)分析

LcTRIM25核苷酸序列通過(guò)MEGA7.0軟件翻譯為氨基酸序列[37], 并通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)多個(gè)物種的TRIM25基因進(jìn)行多序列比對(duì)。利用ExPAsy(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對(duì)LcTRIM25蛋白進(jìn)行序列分析。另外, 利用SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)LcTRIM25蛋白結(jié)構(gòu)域。TRIM25基因系統(tǒng)發(fā)育分析是在不同物種的TRIM25氨基酸序列基礎(chǔ)上, 采用MEGA7.0軟件中的一種自下向上(聚集)的聚類方法——相鄰連接(NJ)方法生成系統(tǒng)進(jìn)化樹[38]。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析

用Trizol方法提取凍存的poly(I:C)感染大黃魚的外周血、脾臟、頭腎和肝臟組織的總RNA,RNA濃度和純度的檢測(cè)同1.2, 使用SuperScriptTMIII反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 合成第一鏈cDNA。根據(jù)克隆獲得的LcTRIM25基因編碼序列, 利用primer premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物TRIM25-RT-F/TRIM25-RT-R (表 1)。管家基因β-actin[39]為本實(shí)驗(yàn)內(nèi)參基因, 內(nèi)參基因是LcTRIM25基因表達(dá)的內(nèi)部參照物, 是實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)系統(tǒng)工作時(shí)的某種標(biāo)準(zhǔn),β-actin熒光定量引物β-actin-RT-F/β-actin-RT-R (表 1)。

用SYBR?Premix ExTaq? (TaKaRa, Japan)試劑在ABI 7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, USA)上檢測(cè)LcTRIM25基因在各組織的相對(duì)表達(dá)量, 每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)時(shí)熒光定量20 μL PCR反應(yīng)體系: 0.8 μL上下游引物、0.4 μL ROX Reference Dye II、10 μL TB Green Premix ExTaqII、1 μL cDNA模板, 7 μL DEPC水。熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束, 利用2-ΔΔCt方法分析LcTRIM25基因表達(dá)量, 并通過(guò)SPSS軟件中方差分析(ANOVA)了解實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組基因表達(dá)差異, 采用鄧肯(Duncan)多重比較法分析基因相對(duì)表達(dá)量[40]。采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SE)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果,P＜0.05為具有顯著性差異,P＜0.01為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大黃魚TRIM25基因序列分析

經(jīng)擴(kuò)增、測(cè)序獲得LcTRIM25基因編碼序列全長(zhǎng)為2097 bp, GenBank登錄號(hào): MK327541, 編碼698個(gè)氨基酸。ExPAsy在線軟件預(yù)測(cè)LcTRIM25蛋白分子量為77.99 kD, 分子式為C3404H5402N966O1047S43,理論等電點(diǎn)是8.66, 富含絲氨酸(Ser, 11%)、亮氨酸(Leu, 8.6%)和賴氨酸(Lys, 7.6%)。利用在線軟件SMART預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域, LcTRIM25蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)未包含信號(hào)肽, 包括3個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域, 分別是RING結(jié)構(gòu)域(第20—57位氨基酸)、B-box2結(jié)構(gòu)域(第151—191位氨基酸)、Coiled-coil結(jié)構(gòu)域(第227—281位氨基酸)和可變的C末端PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域(第523—697位氨基酸)。

2.2 TRIM25蛋白多序列比對(duì)

經(jīng)Blastx在線軟件分析發(fā)現(xiàn)LcTRIM25氨基酸序列與斜帶石斑魚TRIM25氨基酸序列同源性較高(67%)。另外, LcTRIM25氨基酸序列與人類(Homo sapiens, XM_005082.4)、小鼠(Mus musculus, NM_009546.2)、雞(Gallus gall, NM_001318458.1)、非洲爪蟾(Xenopus laevis, XM_018238270.1)、斑馬魚(NM_200175.1)和斜帶石斑魚(KX_258199.1)的TRIM25氨基酸序列利用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM25蛋白結(jié)構(gòu)域序列相似性相對(duì)較高; 并且大黃魚和斜帶石斑魚TRIM25氨基酸序列具有較高同源性, 與Blastx分析結(jié)果相同。

2.3 TRIM25基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

收集來(lái)自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的不同物種(兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類和硬骨魚類)TRIM25基因序列。在TRIM25氨基酸序列基礎(chǔ)上, 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 1)。TRIM25系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示分為單獨(dú)的三支, 分別是哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物和鳥類聚集為一支; 硬骨魚類聚為一支; 兩棲動(dòng)物為一支。其中, 哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物和鳥類各自為一小支, 說(shuō)明哺乳動(dòng)物, 爬行動(dòng)物和鳥類的TRIM25基因同源性很高。另外, 系統(tǒng)進(jìn)化樹表明大黃魚TRIM25基因與鱸形目斜帶石斑魚同源性較高, 親緣關(guān)系最近; 與兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類和哺乳動(dòng)物同源性相對(duì)低。

2.4 LcTRIM25基因組織表達(dá)分析

本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR方法檢測(cè)健康大黃魚肌肉、皮膚、腦、腸、外周血、心臟、脾臟、頭腎、肝臟9個(gè)正常組織中LcTRIM25基因的表達(dá)。qRTPCR結(jié)果表明,LcTRIM25基因在被檢測(cè)的9個(gè)組織中廣泛表達(dá), 但表達(dá)量相對(duì)較低(圖 2)。LcTRIM25基因在不同組織中的表達(dá)水平存在差異, 以表達(dá)量為1的肌肉組織為參考, 在肝臟中表達(dá)量最高, 約為對(duì)照組3倍, 在心臟中表達(dá)量最低, 約為對(duì)照組1/300倍(圖 2), 這種差異性表達(dá)可能是由不同的組織表達(dá)模式所誘導(dǎo)。

2.5 LcTRIM25基因在poly(I：C)感染后的時(shí)序表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示, 在poly(I:C)感染大黃魚后,LcTRIM25基因在各組織中(外周血、頭腎、脾臟和肝臟)的表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著升高(圖 3)。在外周血中LcTRIM25基因的表達(dá)量在24h達(dá)到最高,24—48h表達(dá)量逐漸降低(圖 3A); 在頭腎中LcTRIM25基因表達(dá)水平在12h達(dá)到最高峰后出現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖 3B); 在脾臟中LcTRIM25基因表達(dá)量在6h到達(dá)峰值, 從6—48h期間表達(dá)量逐漸下降(圖 3C); 在肝臟中,LcTRIM25基因表達(dá)量從3—6h期間呈現(xiàn)下降趨勢(shì), 在6—12h表達(dá)量逐漸上升并在12h達(dá)到最高值, 之后表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖 3D)。

3 討論

在之前的研究中根據(jù)TRIM家族成員結(jié)構(gòu)域的組成以及進(jìn)化角度將TRIM家族分為兩大類(Group1, Group2): Group1包含除SPRY結(jié)構(gòu)域的多種C末端結(jié)構(gòu)域, 進(jìn)化較慢, 結(jié)構(gòu)保守; Group2的特征是C端具有SPRY結(jié)構(gòu)域并且僅具有B-box2結(jié)構(gòu)域, 而且Group2的進(jìn)化速度比Group1更快速[41—43]。在本研究中, 大黃魚TRIM25基因通過(guò)擴(kuò)增、測(cè)序獲得其編碼序列全長(zhǎng)2097 bp, 編碼698個(gè)氨基酸;蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LcTRIM25從N端到C端具有保守的結(jié)構(gòu)域(RING、B-box2和Coiled-coil)和可變的C末端PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域; 另外, 多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明LcTRIM25基因與鱸形目斜帶石斑魚TRIM25基因的同源性較高, 而且系統(tǒng)進(jìn)化樹表明大黃魚與哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類和兩棲動(dòng)物TRIM25基因同源性相對(duì)低。這可能是因?yàn)椴煌锓N所處環(huán)境不同, 面對(duì)不同的環(huán)境選擇壓力, 導(dǎo)致不同的進(jìn)化速度和進(jìn)化方向[42]。這些分子特征分析說(shuō)明大黃魚TRIM25基因?qū)儆贕roup2 TRIM家族。

圖1 TRIM25基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ)Fig. 1 Phylogenetic trees of TRIM25 gene (Neighbor-joining)

研究發(fā)現(xiàn)Group2的TRIM家族成員在病毒感染的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[42,44,45], 例如TRIM27通過(guò)靶向作用IKKs負(fù)調(diào)控參與抗病毒應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[44],TRIM21在泛素化非降解途徑中有助于巨噬細(xì)胞天然免疫的激發(fā)[46]和TRIM5α被認(rèn)為是先天性細(xì)胞對(duì)HIV-1抗性的物種特異性介質(zhì)[47]等。在本研究中, qRT-PCR結(jié)果顯示LcTRIM25在健康大黃魚9個(gè)正常組織中廣泛存在,但表達(dá)水平相對(duì)較低, 這與斜帶石斑魚TRIM25基因[31]和韓國(guó)鳑鲏(Rhodeus uyekii)TRIM25基因[48]研究一致。LcTRIM25基因在肝臟中達(dá)到最高表達(dá)量,這可能是為了滿足肝臟在體內(nèi)進(jìn)行新陳代謝的需要, 而且在頭腎、腸和肌肉中表達(dá)量較高, 說(shuō)明大黃魚TRIM25基因在免疫相關(guān)組織中高度表達(dá)。

另外, 早有研究證明硬骨魚類TRIM25基因?qū)Σ《靖腥揪哂锌焖夙憫?yīng)模式。大西洋鮭感染傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)[30]和斜帶石斑魚感染poly(I:C)或石斑魚虹彩病毒(SGIV)時(shí)[31],TRIM25基因表達(dá)水平都呈現(xiàn)迅速上升后下降趨勢(shì)。本研究對(duì)LcTRIM25基因在健康大黃魚注射poly(I:C)后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平變化進(jìn)行檢測(cè)。LcTRIM25基因在外周血、頭腎、脾臟和肝臟中表達(dá)量迅速增加, 均出現(xiàn)上升到達(dá)峰值后下降的趨勢(shì); 其中頭腎和脾臟中LcTRIM25基因表達(dá)量在6h達(dá)到峰值; 肝臟中LcTRIM25基因表達(dá)量在12h達(dá)到峰值; 外周血中LcTRIM25基因在24h達(dá)到最高表達(dá)水平且上調(diào)幅度最大, 這可能是因?yàn)橥庵苎菣C(jī)體重要的免疫場(chǎng)所, 外周血中含有可以直接參與免疫反應(yīng)的白細(xì)胞[32], 另外, poly(I:C)通過(guò)腹腔注射入大黃魚體內(nèi)隨外周血液循環(huán)擴(kuò)散到主要免疫組織, 組織感染poly(I:C)后迅速反應(yīng), 從而TRIM25基因在相關(guān)免疫組織中表達(dá)水平比在外周血中更快到達(dá)峰值, 而在血液循環(huán)過(guò)程中TRIM25基因一直持續(xù)表達(dá)。這說(shuō)明大黃魚TRIM25基因可能在先天免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖2 LcTRIM25基因在大黃魚健康組織中的表達(dá)Fig. 2 Tissue specific expression of LcTRIM25 gene in healthy Larimichthys crocea

綜上所述, 經(jīng)過(guò)分子克隆、測(cè)序首次確定大黃魚TRIM25基因編碼序列全長(zhǎng), 并檢測(cè)LcTRIM25基因在健康大黃魚以及感染poly(I:C)后的表達(dá)量變化。LcTRIM25基因在被檢測(cè)的健康大黃魚各個(gè)組織中均表達(dá), 在肝臟中表達(dá)量最高; 健康大黃魚注射poly(I:C)后,LcTRIM25基因在免疫組織中表達(dá)水平迅速上調(diào), 且不同組織中LcTRIM25基因表達(dá)模式具有差異性。初步推測(cè)大黃魚TRIM25基因可能在先天抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用, 為研究Group2 TRIM家族成員在硬骨魚類中的抗病毒免疫應(yīng)答提供理論參考。

圖3 LcTRIM25基因在poly(I:C)刺激后的時(shí)序表達(dá)Fig. 3 The relative expression of LcTRIM25 gene after poly(I:C) challenge