楊 璐 韓鳳祿 戚常樂 郭建林 盧建挺 徐 暢 劉 爽黃志鵬 王曉丹 陳立僑

(1. 華東師范大學生命科學學院, 水生動物營養(yǎng)與水環(huán)境健康實驗室, 上海 200241; 2. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313001)

豆粕、棉粕、菜粕等植物蛋白源價格低廉, 產(chǎn)量高, 將其添加到水產(chǎn)配合飼料中替代魚粉已漸成研究熱點和飼料開發(fā)的趨勢[1]。然而, 植物原料中存在的抗營養(yǎng)因子如植酸等, 會對動物體的攝食、生長和養(yǎng)殖環(huán)境產(chǎn)生不利影響。植酸, 又被稱為肌醇六磷酸, 是植物蛋白原料中一種常見的熱穩(wěn)定性抗營養(yǎng)因子, 它是陽離子和高能磷酸基的儲存體,是植物種子和谷物在成熟過程中自然形成的化合物[2]。植酸在豆粕、菜粕中含量達到1%—5%[3,4],當在飼料中添加高比例植物蛋白源時, 其負面影響就會顯露出來[5]。對羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)[6]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[7]、大西洋鮭(Salmo salarL.)[8]等動物的研究證實, 飼料中的植酸會降低消化酶活性, 降低生長性能; 此外, 一些水產(chǎn)動物如魚類及甲殼類等, 其消化道不能分泌植酸酶[9], 故對于含有植酸的飼料不能進行有效的分解[10], 大部分植酸最終排入水體, 除造成礦物質(zhì)元素的浪費, 甚至還將污染養(yǎng)殖環(huán)境。已有研究表明, 植酸的抗營養(yǎng)作用是植物性原料替代魚粉有待解決的問題之一[11]。植酸酶, 一種廣泛存在于自然界中的細胞外酶[12], 作為一種磷酸酶它能夠?qū)Ｒ恍缘膶χ菜徇M行逐級分解, 可消除植酸的負面作用[13]。在斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)[14]的研究中發(fā)現(xiàn), 外源補充植酸酶分解了植酸蛋白化合物,改善蝦體的生長性能、提高對蛋白質(zhì)的消化利用率。同樣的, 在真鯛(Pagrus major)[15]飼料中添加2000 U/kg的植酸酶能夠顯著降低磷排泄, 經(jīng)濟效益和生態(tài)效益著。植酸酶對植酸的改善作用是近年來水產(chǎn)動物營養(yǎng)的一個研究熱點。

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis), 俗稱河蟹, 是我國淡水蟹養(yǎng)殖中產(chǎn)量最高的經(jīng)濟物種。隨著中華絨螯蟹配合飼料開發(fā)和應(yīng)用比例的提高, 飼料中植物蛋白原料占比也越來越重[16], 有效提高植物原料的替代比例, 提高飼料效率, 能夠給中華絨螯蟹養(yǎng)殖帶來很多更多的經(jīng)濟效益。植酸酶作為一種飼料添加劑所開展的營養(yǎng)研究已成為熱點, 但目前有關(guān)植酸酶在中華絨螯蟹飼料中的研究還未見報道。本研究參考Nicolasa等[3], 在飼料中添加10 g/kg植酸鈉, 并通過在飼料中添加不同濃度的植酸酶,探討其對幼蟹作用特點, 觀察其在幼蟹的生長、消化性能及營養(yǎng)物質(zhì)利用方面產(chǎn)生的影響, 從而確定植酸酶的適宜添加量, 結(jié)果為今后中華絨螯蟹飼料配方的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料制作

本實驗依據(jù)中華絨螯蟹營養(yǎng)需求, 以魚粉、酪蛋白和明膠為主要蛋白源, 魚油和豆油為脂肪源,不含植酸和植酸酶的組別作為對照組(C), 處理組在含有10 g/kg植酸的基礎(chǔ)上, 添加0、500、1000、1500和2000 U/kg的植酸酶, 分別命名為P0、P500、P1000、P1500和P2000。實驗飼料配方組成和化學分析見表 1。在所有飼料原料混勻后, 使用F-26雙螺桿擠條機(華東理工大學科技實業(yè)總廠, 中國)加工成直徑為1 mm的條狀飼料, 期間監(jiān)測螺桿最高溫度不高于55℃, 保證溫度不會影響植酸酶活力。在室溫下風干后, 同樣利用擠條機將飼料破碎,使用10目、16目及26目篩子, 將飼料分成不同規(guī)格的顆粒, 用自封袋分裝好, 每組做好標簽并儲存于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗在浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店綜合試驗基地進行。幼蟹購自上海崇明島, 暫養(yǎng)結(jié)束后, 將720只附肢完整、健康的幼蟹(4.34±0.05) g隨機分入24個水族桶, 水族桶直徑1 m, 水深45 cm。共6組, 每組設(shè)置4個重復, 每桶30只幼蟹。每個桶中放入6片瓦片及6個由無毒無味的塑料管捆成的躲避物, 供幼蟹藏匿, 以避免相互殘殺。每天在6:30、16:30和21:30飽食投喂, 根據(jù)幼蟹的攝食情況及時調(diào)整投喂量, 確保殘餌較少。投喂2h后吸出殘餌并烘干、稱重、記錄, 并根據(jù)蟹體大小適當調(diào)整投喂飼料的顆粒規(guī)格。在實驗過程中每天換水量占總水體1/3, 水溫維持在(24±2)℃, 溶解氧＞7.0 mg/L, 總氨氮＜0.2 mg/L。養(yǎng)殖過程中若發(fā)現(xiàn)死蟹, 及時撈出并記錄日期、重量。養(yǎng)殖試驗為期8周。

1.3 樣品處理

在8周養(yǎng)殖結(jié)束后, 饑餓處理24h后取樣。每桶取5只幼蟹用于體組成生化分析, 其余的置于冰上麻醉, 采集肝胰腺、腸道凍存于-80℃冰箱待檢。

1.4 消化率實驗

消化率試驗采用體外消化, 具體參照Huang等[17]和Liu等[18]的方法。將幼蟹置于冰上, 取其胃、肝胰腺和腸道, 清除腸道內(nèi)容物后稱量總消化道重量。加入10倍體積預(yù)冷生理鹽水(4℃, 0.9%), 用電動勻漿機在冰浴條件下勻漿。4℃, 5000 r/min離心10min, 丟棄上層脂質(zhì)取上清液作為粗酶液, -80℃凍存, 備用。每個處理設(shè)置3個平行。將1 g飼料與2.5 mL粗酶液加入透析袋中扎好, 放入100 mL帶塞錐形瓶中, 再加入47.5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液, 置于37℃的恒溫水浴振蕩器中, 以50 r/min進行離體酶解消化8h。每個樣品3個平行, 每個處理重復2次。

1.5 生化分析

取適宜大小的肝胰腺、腸道組織塊, 按1:9(m:v)的比例加入預(yù)冷的生理鹽水, 制成10%勻漿液,2500 r/min 離心10min, 取上清液待測。胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及總蛋白含量試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 按具體說明進行檢測。其中,胰蛋白酶: N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)測定法。一個活力單位定義為在pH 8.0, 37℃條件下, 每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003; 淀粉酶: 淀粉-碘顯色法。一個活力單位定義為每毫克蛋白在37℃與底物作用30min, 水解10 mg淀粉。脂肪酶: 化學比濁法。酶活力定義: 在37℃條件下, 每毫克蛋白在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1min, 每消耗1 μmol底物為一個酶活力單位?？偟鞍缀? 考馬斯亮蘭法, 單位為mg/mL。

全蟹的常規(guī)體組生化成分的分析參考 AOAC(1995)的標準方法。水分測定采用 105℃烘干至恒重法, 粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法(FOSS,Kjeltec2200, Denmark), 粗脂肪測定采用氯仿甲醇法(CM法), 灰分測定采用馬弗爐550℃灼燒恒重稱量法, 總磷采用鉬黃分光光度法, 植酸磷含量測定采用三氯乙酸法(TCA法)。

1.6 生長、消化性能測定

各指標計算公式如下:

其中N0和Nt分別為實驗開始和結(jié)束時蟹的個數(shù);W0和Wt分別為幼蟹初始和終末重量(g);W為蟹體總增重(g);IF為試驗期間總攝食飼料干重(g);IN為試驗期間總攝食飼料蛋白質(zhì)質(zhì)量(g); d為試驗天數(shù);Ni/Nf為蟹體初始/最終某營養(yǎng)成分含量(%);Nd為飼料某營養(yǎng)成分含量(%);m為飼料樣品質(zhì)量(mg);m1為濾渣質(zhì)量(mg);Lp為濾渣粗蛋白含量(%);m2為透析液中可透析磷/鈣質(zhì)量(mg)。

表1 飼料配方及成分分析(風干基礎(chǔ), %)Tab. 1 Diet formulation and analyzed chemical composition (air dry basis, %)

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤(Mean±SE)表示,先用SPSS19.0進行單因素方差(One-way ANOVA)分析, 若存在顯著差異(P＜0.05), 則采用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹生長和飼料利用的影響

如表 2所示, 幼蟹的初始體重無顯著性差異(P＞0.05)。隨著飼料中植酸酶含量的增加, 幼蟹終末體重、增重率、特定生長率逐漸升高, P2000顯著高于P0 (P＜0.05), 對照組與各處理組無顯著差異(P＞0.05); 各處理組蛋白質(zhì)效率都高于P0, P2000及對照組顯著高于P0 (P＜0.05); 飼料系數(shù)方面則是P0顯著高于P2000 (P＜0.05), 其余組之間無顯著差異(P＞0.05); 各實驗組之間的存活率、攝食量等無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 植酸酶對中華絨螯蟹體成分的影響

如表 3所示, 隨著植酸酶含量增加, 全蟹體磷含量逐漸升高, 其中P1500及P2000顯著高于P0(P＜0.05), 其余各處理組之間沒有出現(xiàn)顯著性的差別(P＞0.05); 各實驗組在水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分及鈣含量方面無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 植酸酶對中華絨螯蟹消化道消化酶的影響

在肝胰腺中, P0胰蛋白酶活力與P500差異不顯著(P＞0.05), 但顯著低于其他各組(P＜0.05); 淀粉酶活力則是P2000顯著高于其他各組(P＜0.05); 脂肪酶活力各實驗之間差異性不顯著(P＞0.05)。在腸道中, P2000胰蛋白酶活力與對照組差異不顯著, 但顯著高于其他各組(P＜0.05); 脂肪酶和淀粉酶活力各實驗組之間差異性不顯著(P＞0.05, 表 4)。

2.4 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹體外消化率的影響

各實驗組在干物質(zhì)消化率及鈣透析率方面差異性不顯著(P＞0.05); 蛋白質(zhì)消化率隨植酸酶含量的升高而逐漸升高, P2000顯著高于P0 (P＜0.05), 但與對照組沒有顯著性差異(P＞0.05); 磷透析率有同樣的升高趨勢, 在P1000、P1500及P2000顯著性地高于P0 (P＜0.05), P2000顯著性高于對照組(P＜0.05,表 5)。

2.5 氮磷保留率

結(jié)果顯示, 各實驗組幼蟹對氮、磷攝入量差異不顯著(P＞0.05); 與P0相比, 添加植酸酶提高了幼蟹氮、磷保留率。P2000氮保留率顯著高于各處理組(P＜0.05); P2000磷保留率顯著高于P0組(P＜0.05),與其余組沒有顯著的差異(P＞0.05, 表 6)。

表2 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹生長性能的影響Tab. 2 Effects of phytase on the growth performance of the juvenile crab Eriocheir sinensis

3 討論

已有研究表明, 植物蛋白源能否有效替代優(yōu)質(zhì)的魚粉, 前提是要先消除其抗營養(yǎng)因子的不利影響。然而, 熱穩(wěn)定性抗營養(yǎng)因子采用常規(guī)方法往往難以去除, 例如植酸等。已有研究證實, 由于其特有的螯合性質(zhì), 配合飼料中的植酸會降低動物體對飼料的消化利用率和物質(zhì)保留率, 從而抑制機體的生長速度[19]。飼料中植酸含量超過13 g/kg時, 日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼魚的攝食量和增重率都會顯著降低[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)10 g/kg植酸對中華絨螯蟹生長有抑制作用, 并會降低蛋白質(zhì)效率,導致飼料系數(shù)升高, 植酸對幼蟹的負面效應(yīng)突顯。而這種阻抑作用可隨著植酸酶添加而得到緩解, 表現(xiàn)為幼蟹的生長性能逐漸得到改善和提高, 當植酸酶含量添加到2000 U/kg時, 中華絨螯蟹的增重率、特定生長率都有顯著的提高。與本研究相似, 當凡納濱對蝦攝食2000 FTU/kg植酸酶預(yù)處理的大豆粉時, 增重率可達到不添加植酸酶的1.39倍[21], 表明元飼料中添加適量植酸酶有利于提高蝦、蟹類甲殼動物的生長性能。究其原因, 植酸酶能夠有效地作用于植酸, 使植酸逐步去磷酸化生成一系列低肌醇磷酸酯, 并最終產(chǎn)生自由肌醇與無機磷的過程[22],由此消除植酸對礦質(zhì)磷及其他營養(yǎng)物質(zhì)的螯合作用, 這無疑有利于甲殼動物對鈣、磷等礦物元素的吸收利用。實驗同時發(fā)現(xiàn), 在添加合理劑量的植酸酶后, 中華絨螯蟹的飼料系數(shù)顯著降低, 同時蛋白質(zhì)效率顯著提高。在大西洋鮭[23]的實驗中也發(fā)現(xiàn)同樣結(jié)果, 加入植酸酶后飼料系數(shù)從0.84降低至0.75。飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率是衡量水產(chǎn)動物對飼料利用效率的重要依據(jù)[24], 由此可見, 添加植酸酶提高了飼料的利用率, 促進了機體的物質(zhì)積累, 有效改善了生長性能。

表3 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹全蟹體成分的影響Tab. 3 Effects of phytase on the composition of whole crabs of the juvenile crab Eriocheir sinensis (%)

表4 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹消化酶活力的影響Tab. 4 Effects of phytase on digestive enzymes of the juvenile crab Eriocheir sinensis (U/g prot)

表5 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹體外消化率的影響 (%)Tab. 5 Effects of phytase on the in vitro digestibility of the juvenile crab Eriocheir sinensis (%)

表6 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹氮磷保留的影響Tab. 6 Effects of phytase on nitrogen and phosphorus retention of the juvenile crab Eriocheir sinensis

中華絨螯蟹是一種雜食偏肉食性動物, 在其分泌的消化酶中, 胰蛋白酶完成大部分蛋白質(zhì)的水解作用, 起到主要的消化功能, 淀粉酶、脂肪酶活性略低[25]。飼料中的植酸會顯著降低中華絨螯蟹胰蛋白酶活性, 因為植酸對金屬離子有強烈的螯合特性, 植酸會與酶蛋白爭奪輔因子而致使消化酶活力下降。同時, 飼料中的蛋白質(zhì)也會被作為植酸的優(yōu)選結(jié)合底物[26], 被植酸絡(luò)合后無法完全有效供給動物體吸收利用[19], 這樣就會降低中華絨螯蟹對蛋白質(zhì)的利用。實驗發(fā)現(xiàn)當植酸酶添加量達到2000 U/kg時, 中華絨螯蟹肝胰腺胰蛋白酶活力明顯升高, 且達到與對照組相當?shù)乃? 表明該植酸酶劑量能有效緩解了植酸對消化酶的抑制, 提高機體對蛋白質(zhì)的消化利用率。此外, 肝胰腺中淀粉酶活力的提高可能與植酸酶釋放的金屬離子Ca2+有關(guān)[19], 相關(guān)的具體過程和內(nèi)在機制尚有待進一步研究。

甲殼動物的生長伴隨著蛻殼而實現(xiàn), 這一過程中將會伴隨一些礦物質(zhì)元素的損失, 所以飼料中鈣磷含量, 以及兩者之間的比例對于維持體壁結(jié)構(gòu)起重要作用[27]。為了保證蛻殼的順利完成, 甲殼動物會在蛻殼期儲存磷, 這些磷主要來源于肝胰腺和血淋巴, 飼料中磷的缺乏會造成蛻殼延緩或蛻殼不遂,最終導致生長受阻, 甚至死亡[28]。本實驗所用礦物質(zhì)配方參考Ma等[29]和Cui等[30], 且符合陳立僑等[31]對中華絨螯蟹飼料中鈣磷比的研究: 當餌料中含鈣量為0.5%、Ca/P比為1:1.9時, 幼蟹獲得最大生長率和較高蛋白質(zhì)利用率, 滿足中華絨螯蟹對礦物質(zhì)磷的基本需求。有學者報道, 當羅氏沼蝦飼料中植酸含量超過21.45 g/kg時, 蝦體總磷含量顯著的降低[6]。但當南美白對蝦(Litopenaeu vannamei)飼料中添加2000 U/kg植酸酶時, 磷的消化率由37%有效提高至47%[32]。植酸酶還能有效降低動物體磷的排泄量,顯示出效用價值[33]。飼料中的植酸會螯合礦物質(zhì)磷, 而甲殼動物這類單胃動物基本無法消化植酸磷。在本研究中, 飼料中植酸酶分解植酸, 提高有效磷含量, 進而也提高了中華絨螯蟹對磷的消化利用。磷保留率由20.89%顯著上升到41.29%, 有效降低了元素的損失率。

有研究指出, 植物蛋白源替代魚粉可能會損失更多的氮元素, 當水生動物攝食氨基酸不平衡的飼料, 會分解不能利用的氨基酸, 導致的過多排泄[34]。水體中氨氮大部分來源于動物體自身排泄, 若氨氮含量過高, 非離子氨會通過鰓滲入血液, 對動物體產(chǎn)生毒害作用, 致使代謝異常,甚至死亡[35]。本實驗結(jié)果表明, 由于植酸螯合物的不可消化性, 中華絨螯蟹在攝入氮元素相同的情況下, 植酸添加組中華絨螯蟹的氮保留率較低。而在添加植酸酶后, 飼料中氮物質(zhì)的利用得以提高, 蟹體氮保留率由18.47%顯著上升至25.78%。提示植酸酶能夠有效消除植酸對氮營養(yǎng)物質(zhì)的結(jié)合作用, 促使植酸釋放出一些氨基酸、以及大分子蛋白質(zhì)物質(zhì), 供給動物體有效消化吸收和利用, 從而降低飼料氮的排泄, 這對于養(yǎng)殖水環(huán)境的保護也是有益的[10]。

4 總結(jié)

與不添加植酸酶處理組相比, 隨著飼料中植酸酶的添加, 中華絨螯蟹肝胰腺中胰蛋白酶、對磷與蛋白質(zhì)的消化利用率逐漸提高。飼料中添加2000 U/kg植酸酶能顯著提高幼蟹的增重率, 提高機體的磷含量、氮/磷保留率和飼料效率。