努日比婭姆·麥麥提托合提，張 博，趙 茜，阿爾曼·海熱，宋玉坤，劉國(guó)世，阿布力孜·吾斯曼*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物胚胎工程實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

隨著哺乳動(dòng)物體外受精-胚胎移植、轉(zhuǎn)基因、細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射等技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)高質(zhì)量卵母細(xì)胞及胚胎的需求日益增加，體內(nèi)排出卵母細(xì)胞供不應(yīng)求[1]。未成熟卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）是提高胚胎體外生產(chǎn)效果的關(guān)鍵一步。卵母細(xì)胞在體外成熟過程中易受外界環(huán)境影響，其中活性氧（ROS）造成的損傷是降低細(xì)胞成熟質(zhì)量的主要原因，并可引起胚胎發(fā)育停滯[2]。向培養(yǎng)基中添加適量抗氧化劑能夠改善體外培養(yǎng)微環(huán)境，是促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟獲得高質(zhì)量細(xì)胞的重要途徑之一[3]。白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是一種天然的高效抗氧化劑，能夠避免過多ROS 引起的氧化損傷，促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟與胚胎體外發(fā)育[4]。豬卵母細(xì)胞IVM 液中添加RES能夠維持其氧化還原平衡，促進(jìn)細(xì)胞體外成熟[5]。山羊卵母細(xì)胞IVM 液中添加RES 顯著提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）水平，最終改善孤雌生殖和手工克隆胚胎發(fā)育潛力[6]。綿羊[7]、牛[8]卵母細(xì)胞IVM 液中分別添加RES 能夠促進(jìn)細(xì)胞體外成熟，提高受精率、囊胚率及囊胚平均細(xì)胞數(shù)。目前，在國(guó)內(nèi)尚未報(bào)道RES 對(duì)綿羊卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同濃度RES 對(duì)綿羊卵丘細(xì)胞擴(kuò)展和卵母細(xì)胞第一極體排出及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ROS 和GSH 水平的影響，探究RES 卵母細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激能力，促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟的調(diào)控機(jī)制，為卵母細(xì)胞體外成熟的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）、雌二醇（E2）、無脂肪酸-BSA、肝素鈉、透明質(zhì)酸酶等購(gòu)自Solarbio 公司；RES、TCM199、聚乙烯醇（PVA）、HEPES、HEPES-Na、酚紅、NaHCO3、葡萄糖、乳酸鈉、丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素、礦物油、無機(jī)鹽等均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；CMF2HC，H2DCFDA 購(gòu)自Invitrogen 公司。

1.1.3 試劑配制 采卵液：9.5 g/L TCM199，4 g/L BSA，2500 U/L 肝素鈉，5 mmol/L NaHCO3，0.01 g/L 酚紅，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L HEPES-Na，100 mg/L青霉素，100 mg/L 鏈霉素，4℃保存。

體外成熟基礎(chǔ)液：9.5 g/L TCM199，6 g/L BSA，500 U/L FSH,500 U/L LH，1 mg/L E2，25 mmol/L NaHCO3，5.5 mmol/L 乳酸鈉，2 mmol/L 丙酮酸鈉，1.5 mmol/L葡萄糖，0.1 g/L 青霉素，0.1 g/L 鏈霉素。用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，4℃保存。

0.1% 透明質(zhì)酸酶：1 g/L 透明質(zhì)酸酶，9.5 g/L TCM199，2.1 g/L NaHCO3，-20℃保存。

DPBS：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.05 g/L KH2PO4，2.17 g/L Na2HPO4·7H2O，0.13 g/L CaCl2·2H2O，0.1 g/L MgCl2·6H2O；pH 調(diào)至7.2～7.4，在4℃保存。

Tyrodes medium：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.2 g/L CaCl2·2H2O，0.1 g/L MgCl2·6H2O，0.05 g/L NaH2PO4，1 g/L NaHCO3，4℃保存。

DPBS-PVA：1 g PVA 熱溶于1 L DPBS 中。

熒光染色工作液：10 μmol/L H2DCFDA（ROS），10 μmol/L CMF2HC（GSH），現(xiàn)配現(xiàn)用。

配制RES 濃度：對(duì)照組為基礎(chǔ)培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加0.5、2.0、5.0 μmol/L RES 配成不同RES 濃度的IVM 液，4℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵母細(xì)胞收集及體外培養(yǎng) 將采自新疆烏魯木齊市新華凌羊屠宰場(chǎng)的綿羊卵巢裝在含雙抗38.5℃的生理鹽水中，在2～4 h 內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，用生理鹽水輕緩清洗3 遍。將38.5℃預(yù)熱的適量采卵液倒入90 mm 的塑料培養(yǎng)皿中，將清洗完的卵巢（5～10 個(gè)）放置此培養(yǎng)皿中，用眼科鑷和23 號(hào)的手術(shù)刀片進(jìn)行卵泡輕柔緊密割卵，從而使卵母細(xì)胞流入采卵液。在體視顯微鏡下，挑選出卵丘顆粒細(xì)胞緊密包圍和細(xì)胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞。用洗卵液清洗3 次，移入已預(yù)熱70 μL 的成熟培養(yǎng)滴中，在38.5℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟24 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 添加不同濃度RES 對(duì)體外成熟綿羊卵丘擴(kuò)展率和卵母細(xì)胞核成熟的影響 使用含有不同濃度RES（0、0.5、2.0、5.0 μmol/L）的IVM 培養(yǎng)基成熟綿羊卵母細(xì)胞24 h，并觀察卵丘擴(kuò)展率情況，統(tǒng)計(jì)第一極體形成率。將收集的卵母細(xì)胞隨機(jī)分為4 組，分別進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.3.2 添加不同濃度RES 對(duì)體外成熟綿羊卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中ROS 和GSH 含量的影響 使用含不同濃度RES（0、0.5、2.0、5.0 μmol/L）的IVM 培養(yǎng)基成熟綿羊卵母細(xì)胞24 h，透明質(zhì)酸酶去除顆粒細(xì)胞后，H2DCFDA（檢測(cè)ROS）或CMF2HC（檢測(cè)GSH）進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)染色，在熒光倒置顯微鏡下采集綠、藍(lán)色熒光圖像，采用Image-pro plus 軟件進(jìn)行分析其積分光密度（IOD）和熒光 面積（AREA），計(jì) 算平均密度（MOD，MOD=IOD/AREA），即為平均熒光強(qiáng)度。平均熒光強(qiáng)度值反映細(xì)胞內(nèi)ROS 和GSH 水平。將卵母細(xì)胞隨機(jī)分為4 組，分別進(jìn)行5 次重復(fù)。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 觀察卵丘細(xì)胞擴(kuò)展情況 卵母細(xì)胞IVM 24 h 后，在體式顯微鏡下直接觀察拍照。采用Vanderhyden B C[9]的分級(jí)方法，將卵丘細(xì)胞擴(kuò)展分為G1、G2、G3、G4 級(jí)。G1 級(jí)：沒有擴(kuò)展，通常卵丘細(xì)胞已經(jīng)貼壁，卵母細(xì)胞已經(jīng)發(fā)黑；G2 級(jí)：最外1～2 層顆粒細(xì)胞有擴(kuò)展；G3 級(jí)：卵丘細(xì)胞呈蓬松狀態(tài)，外側(cè)的幾層細(xì)胞擴(kuò)展，開始呈放射冠，部分未擴(kuò)展；G4：包括放射冠在內(nèi)全部擴(kuò)展開來，細(xì)胞間粘性較弱，而且外周部分細(xì)胞已開始脫落。并把G3，G4 級(jí)擴(kuò)展定為卵丘擴(kuò)展?fàn)顟B(tài)；G1、G2 級(jí)擴(kuò)展定為卵丘未擴(kuò)展?fàn)顟B(tài)。擴(kuò)展率為G3，G4 級(jí)擴(kuò)展細(xì)胞個(gè)數(shù)占總細(xì)胞個(gè)數(shù)的百分率。

1.4.2 觀察第一極體的排出情況 將IVM 24 h 以后的卵母細(xì)胞在0.1%的透明質(zhì)酸酶里用移液槍反復(fù)吹打，脫掉卵丘和顆粒細(xì)胞，吹打時(shí)間控制在30s 內(nèi)，脫完顆粒的卵母細(xì)胞用洗卵液洗3 次，在體視顯微鏡下觀察第一極體排出情況。

1.4.3 卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS 和GSH 的檢測(cè) 通過H2DCFDA和CMF2HC 熒光染料檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 和GSH 水平。將成熟24 h 后脫去顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞用PVA-DPBS洗滌，然后放入含有10 μmol/L H2DCFDA（檢測(cè)ROS）或10 μmol/L CMF2HC（檢測(cè)GSH）的染色液中，并在37℃避光染色30 min。染色后適當(dāng)洗滌，然后放入10 μL的PBS 液滴中，在裝有藍(lán)光/ 紫外線濾光片的熒光倒置顯微鏡上觀察熒光及采集圖像，所有拍照曝光時(shí)間參數(shù)為2.696 s（ROS）和1.493 s(GSH)。通過Image-pro plus 軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用Image-pro plus 軟件檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 和GSH 熒 光 強(qiáng) 度，運(yùn) 用Excel 和SPASS 23.0 的LSD 法進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果

2.1 添加不同濃度RES 對(duì)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展率的影響 如表1 所示，與對(duì)照組相比，添加0.5 μmol/L RES 卵丘細(xì)胞擴(kuò)展率有提高的趨勢(shì)（P>0.05），濃度增至5.0 μmol/L RES時(shí)會(huì)顯著降低卵丘擴(kuò)展率。因此，添加0.5 μmol/L RES并不影響卵丘細(xì)胞擴(kuò)展率。0.5 μmol/L RES 組卵母細(xì)胞第一極體排出率顯著高于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組，對(duì)照組和2.0 μmol/L 試驗(yàn)組之間無顯著差異。隨RES 濃度的增高卵母細(xì)胞第一極體排出率有下降的趨勢(shì)，添加5.0 μmol/L RES 顯著降低卵母細(xì)胞第一極體排出率。結(jié)果表明，5.0 μmol/L RES 對(duì)卵母細(xì)胞核成熟有抑制作用。

表1 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)綿羊卵丘細(xì)胞擴(kuò)展的影響

2.2 添加不同濃度的白藜蘆醇對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ROS 水平的影響 如表2 和圖1 所示，添加0.5 μmol/L RES 顯著降低細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS 含量；5.0 μmol/ RES 組的ROS 水平顯著高于對(duì)照組。由此可知，添加0.5 μmol/L RES 可以顯著改善IVM 綿羊卵母細(xì)胞氧化還原狀態(tài)；5.0 μmol/L RES 對(duì)細(xì)胞成熟有負(fù)面作用。

表2 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ROS 水平的影響

圖1 白藜蘆醇對(duì)成熟后卵母細(xì)胞ROS 和GSH 含量的影響（10x10）

2.3 添加不同濃度的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH 水平的影響如表3 所示，IVM 液中添加0.5 μmol/L RES 顯著提高卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)GSH 含量，高濃度處理組5.0 μmol/L RES 細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)GSH 含量顯著低于對(duì)照組；隨RES 濃度增加綿羊卵母細(xì)胞內(nèi)GSH 含量有逐漸下降的趨勢(shì)。因此，最佳添加濃度0.5 μmol/L RES 可以顯著增強(qiáng)綿羊卵母細(xì)胞IVM 的抗氧化能力，促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)成熟。

表3 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)GSH 水平的影響

3 討 論

IVM 后卵母細(xì)胞排出第一極體是細(xì)胞核成熟的標(biāo)志[10]，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的GSH 含量是細(xì)胞胞質(zhì)成熟程度的一個(gè)特異性指標(biāo)[11]。RES 屬于高效抗氧化劑，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要作用。本研究表明，在綿羊卵母細(xì)胞IVM 培養(yǎng)液中添加不同濃度RES 對(duì)卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟有顯著影響。在IVM 液中添加0.5 μmol/L RES 顯著改善卵母細(xì)胞體外成熟能力，促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展及第一極體的形成；高濃度5.0 μmol/L RES 試驗(yàn)組顯著降低細(xì)胞核成熟率。此結(jié)果與Zabihi 等[7]研究結(jié)果相同，濃度為0.5 μmol/L RES 對(duì)綿羊卵母細(xì)胞核成熟的效果最佳，高濃度5.0 μmol/L RES 有抑制細(xì)胞體外成熟的趨勢(shì)。Liu 等[12]研究發(fā)現(xiàn)在老齡小鼠和人類卵母細(xì)胞成熟液中添加1.0 μmol/L RES 顯著提高第一極體排出率，顯著改善紡錘體和染色體的正常形態(tài)；此外，增強(qiáng)老齡小鼠卵母細(xì)胞中SIRT1、CAT、SOD1 和GPX4 等基因的表達(dá)模式。Wang 等[8]研究表明，1.0 μmol/L RES 能顯著促進(jìn)牛卵丘擴(kuò)展和極體形成，提高卵母細(xì)胞體外受精后囊胚率、孵化囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)。

本研究報(bào)道，0.5 μmol/L RES 顯著降低細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)ROS 含量，提高GSH 含量，從而提高卵母細(xì)胞體外成熟能力。高濃度5.0 μmol/L RES 增加胞質(zhì)內(nèi)ROS 含量，而降低卵母細(xì)胞質(zhì)量。Mukherjee 等[6]得到了相同的研究結(jié)果，在IVM 培養(yǎng)基中添加0.25 μmol/L 和0.5 μmol/L RES 可促進(jìn)山羊卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)成熟，減少細(xì)胞ROS含量并提高細(xì)胞GSH 含量。而Li 等[13]研究報(bào)道，添加2.0 μmol/L RES 不僅改善豬體外熱應(yīng)激條件的卵母細(xì)胞核成熟，而且提高卵母細(xì)胞GSH 水平，降低ROS水平，并可上調(diào)卵母細(xì)胞內(nèi)SIRT1 基因的表達(dá)量。Kwak 等[14]研究得出，適宜濃度的RES 能夠增加細(xì)胞內(nèi)GSH 含量并降低ROS 含量，從而提高豬卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精胚胎的發(fā)育潛能，同時(shí)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟相關(guān)基因的表達(dá)。在豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存液中添加RES 對(duì)未成熟卵母細(xì)胞的損傷及卵母細(xì)胞內(nèi)ROS 和GSH 含量無影響，但在玻璃化冷凍后的豬卵母細(xì)胞IVM 液中添加2.0 μmol/L RES 顯著提高存活卵母細(xì)胞發(fā)育到囊胚期的發(fā)育能力[15]。陳培芳[16]研究表明，低氧培養(yǎng)條件下，適量濃度的RES 顯著提高小鼠2-細(xì)胞、4-細(xì)胞和囊胚內(nèi)抗氧化相關(guān)GPX 1、Mn-SOD、PRDX3、GLS2等基因的表達(dá)。添加1.0 μmol/L RES能夠誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞孕激素分泌和降低胞內(nèi)ROS 水平、提高GSH 水平，并可能通過SIRT1 途徑提高牛卵母細(xì)胞成熟及體外受精后發(fā)育效率[8]。有研究報(bào)道[17]，RES可下調(diào)囊胚中促凋亡相關(guān)Caspase-3、Bcl-2等基因的表達(dá)，上調(diào)Bax基因的表達(dá)，進(jìn)而預(yù)防細(xì)胞凋亡，及阻止因此引起的胚胎發(fā)育損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果差異可能與不同種類動(dòng)物細(xì)胞在不同條件下對(duì)RES 的敏感性有關(guān)。目前，RES 對(duì)綿羊早期胚胎發(fā)育及卵母細(xì)胞凋亡mRNA 水平的影響是本實(shí)驗(yàn)下一步的研究計(jì)劃。

4 結(jié) 論

綿羊卵母細(xì)胞IVM 液中添加0.5 μmol/L RES 能夠促進(jìn)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展及第一極體的形成，而提高卵母細(xì)胞核成熟。同時(shí)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS 含量及提高GSH 含量，并通過提高細(xì)胞抵抗氧化能力促進(jìn)細(xì)胞胞質(zhì)成熟及提高細(xì)胞胞質(zhì)質(zhì)量；高濃度5.0 μmol/L RES 對(duì)綿羊卵母細(xì)胞成熟有抑制作用。