張遙遙,張 夢,胡 悅,任建武

(北京林業(yè)大學(xué),生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

黃精(Polygonatumsibiricum,PS)是我國傳統(tǒng)中草藥,且藥食兩用。黃精性平、味甘,具有滋陰潤肺、健脾之功效[1],包含多糖、皂苷、黃酮、醌類、生物堿、木質(zhì)素和人體必需氨基酸等有效成分[2]。多糖是黃精主要活性成分之一,研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖有調(diào)節(jié)免疫力[3-4]、抗腫瘤[5-6]、降脂降糖[7]、抗炎抑菌[8]等功效。

多糖結(jié)構(gòu)修飾是引入官能團(tuán)、提高多糖生物活性甚至使其產(chǎn)生新活性的有效手段,常見的化學(xué)修飾方法包括六種:硫酸化、磷酸化、乙?；⑼榛?、磺酰化和羧甲基化[9]。多糖的結(jié)構(gòu)修飾已在黑木耳多糖[10]、銀耳多糖[11]、茶多糖[12]、青錢線柳多糖[13]等中得到研究,但關(guān)于黃精多糖結(jié)構(gòu)修飾的研究很少,梁引庫等[14]采用三種方法制備硫酸酯化黃精多糖,修飾前后均具有較好的抗氧化活性;Khamphone等[15]得到取代度分別為0.50、0.94和1.90的三種硫酸化衍生物,并證實(shí)硫酸化黃精多糖有助于激活自然殺傷細(xì)胞?，F(xiàn)有研究主要是黃精多糖硫酸化修飾,未見羧甲基修飾的相關(guān)報(bào)道。本文對(duì)黃精多糖進(jìn)行硫酸化及羧甲基化兩種結(jié)構(gòu)修飾,并對(duì)比修飾前后抗氧化活性的變化,以期為多糖構(gòu)效關(guān)系的進(jìn)一步研究提供思路,并為開發(fā)潛在功能性食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精 采自北京懷柔區(qū),2017年10月;DEAE纖維素、葡聚糖凝膠Sephadex G-200 上海源葉生物科技有限公司;葡萄糖、無水乙醇、三氯乙酸、濃鹽酸、濃硫酸、硫酸銨、氯乙酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、DPPH、ABTS、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、無水氯化鐵、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、雙氧水 以上均為分析純,國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司。

TL-650Y型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 江蘇天翎儀器有限公司;新世紀(jì)T6紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;TGL16M臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī) 上海赫田科學(xué)儀器有限公司;DTQC-10A水浴恒溫振蕩器 北京普析通用儀器有限公司;85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 金壇市華城潤華實(shí)驗(yàn)儀器廠;Spectrum400紅外光譜儀 美國PERKIN ELMER公司;R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琪公司;FA2004型分析天平 上海上平儀器有限公司;DZF真空干燥箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;BS-100A自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠;DHG-9033B5電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;800Y小型粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司;LGJ-10N普通型真空凍干機(jī) 北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司;L100-1S-1型恒流泵 蘭格恒流泵有限公司;Shodex SB-806M示差折光檢測器 北京京京時(shí)代科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃精多糖的提取 參照駱文燦[16]的方法,取篩選后鮮黃精,清洗去須切片,于40 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥12 h,粉碎后過60目篩,粉末常溫干燥保存。取200 g黃精粉,按20∶1 (mL/g)的液料比加入蒸餾水800.0 mL,設(shè)定超聲功率180 W,超聲時(shí)間60 min進(jìn)行超聲提取,然后40 ℃水浴15 min。以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液經(jīng)三氯乙酸法脫蛋白得洗脫液,60 ℃旋蒸至一定體積,加五倍體積無水乙醇在4 ℃冰箱醇沉14 h,經(jīng)8000 r/min離心后得到多糖沉淀,真空凍干,得到粗多糖粉末。

1.2.2 多糖含量測定 參照2015年版《中國藥典》,采用苯酚-硫酸法。即以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品,配制90 μg/mL溶液。分別在6支試管中加入葡萄糖標(biāo)液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL),加水到1.0 mL,分別向其中加入1.0 mL苯酚溶液(5%,W/V),5.0 mL濃硫酸,使總體積為7.0 mL,搖勻后沸水浴20 min,然后立即冰浴5 min,在488 nm處測定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 黃精多糖的純化

1.2.3.1 DEAE-52纖維素柱層析 填料進(jìn)行預(yù)處理、裝柱后,稱取黃精粗多糖粉末500 mg溶于10.0 mL蒸餾水中,離心(8000 r/min)除不溶物,過0.45 μm濾膜得到上清液,用吸管緩慢上樣。分別以兩倍柱體積的蒸餾水、0.2和0.5 mol/L NaCl洗脫液進(jìn)行洗脫。恒流泵調(diào)節(jié)流速為1.0 mL/min,自動(dòng)收集器收集流出液,每管10.0 mL。苯酚-硫酸法跟蹤檢測每管糖含量,收集單峰對(duì)應(yīng)的管內(nèi)溶液,濃縮凍干。重復(fù)蒸餾水洗脫操作,富集得率最高的蒸餾水洗脫部分PSP1,按1.2.1方法濃縮、醇沉、離心、凍干,進(jìn)行下一步純化。

1.2.3.2 葡聚糖凝膠層析 取經(jīng)過DEAE-52分離后的多糖100 mg,溶于2.0 mL蒸餾水中,以脫氣后蒸餾水作為洗脫液上樣洗脫。恒流泵調(diào)節(jié)流速為1.0 mL/min,自動(dòng)收集器每管收集10.0 mL,苯酚-硫酸法跟蹤檢測每管糖含量,收集單峰對(duì)應(yīng)的管內(nèi)溶液,濃縮凍干,得到純化多糖(PSP1-A),重復(fù)蒸餾水洗脫操作,富集多糖。并于室溫放入以五氧化二磷為干燥劑的干燥器中保存。

1.2.4 黃精多糖純度鑒定

1.2.4.1 PSP1-A的紫外全波長掃描分析 取10 mg PSP1粉末,加蒸餾水制備成1.00 mg/mL溶液。取適量溶液于190～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長掃描,蒸餾水調(diào)零,繪制紫外全波長掃描圖。

1.2.4.2 PSP1-A的分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法測定純化多糖的分子量。流動(dòng)相:NaCl、Na2HPO4水溶液;Mw測量范圍:500～109 Daltons;柱溫:25 ℃;流速:0.8 mL/min;色譜柱:SB-802.5HQ;檢測器:Shodex SB-806M示差折光檢測器;進(jìn)樣量:100 μL。

以去離子水為溶劑,真空抽濾處理對(duì)去離子水進(jìn)行過濾和脫氣。以處理后的溶劑配制待測樣品溶液。取10 mg多糖PSP1,加水使待測液濃度為2.00 mg/mL,在室溫下靜止過夜,使粉末充分溶解,可輕微搖動(dòng)樣品以促進(jìn)溶解但不可劇烈搖動(dòng)。樣品溶解后,采用一次性微孔濾膜(孔徑0.2 μm)對(duì)樣品溶液進(jìn)行過濾,取過濾后樣品注入凝膠色譜柱中,根據(jù)ParSEC Chromatography Software軟件計(jì)算相對(duì)分子量。

1.2.5 黃精多糖的硫酸化修飾 參照梁引庫等[14]的研究,量取4.0 mL正丁醇置于冰浴錐形瓶中,加入磁石磁力攪拌,向其中緩慢加入濃硫酸12.0 mL,攪拌5 min后加入300 mg硫酸銨。攪拌10 min混勻后向其中加入800 mg 純化多糖,并攪拌反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后立即以2.5 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH為7.0,4000 r/min離心15 min,取上清用蒸餾水透析3 d,每4 h換一次水。透析后溶液濃縮,五倍無水乙醇醇沉,8000 r/min離心后收集沉淀,真空冷凍干燥,得到硫酸化多糖(SPSP1-A)。

1.2.6 黃精多糖的羧甲基化修飾 參照Machová等[17]的研究,精確稱取純化多糖500 mg,使其充分溶解于38.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的NaOH溶液中,30 ℃恒溫振蕩攪拌60 mim。向反應(yīng)體系中加入6%氯乙酸(W/V,無水乙醇溶解)50.0 mL,充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?55 ℃恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)5 h。冷卻至室溫后以2.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH至中性,透析袋透析3 d(每4 h換一次蒸餾水),濃縮醇沉,真空冷凍干燥,得到羧甲基化多糖(CPSP1-A)。

1.2.7 取代度的測定

1.2.7.1 硫酸基取代度(DS)的測定 采用氯化鋇-明膠比濁法[18]測定硫酸基的取代度。硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取2 g明膠加400.0 mL蒸餾水溶解,于4 ℃冰箱中靜置12 h得到明膠溶液(Ⅰ)。稱取1 g氯化鋇溶解于200.0 mL明膠溶液中得到氯化鋇-明膠溶液(Ⅱ),4 ℃保存?zhèn)溆谩７Q取60 mg硫酸鉀,以1.0 mol/L鹽酸溶液定容至100.0 mL得到硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液(0.60 mg/mL)。分別用移液槍吸取20、60、100、140、180、200 μL標(biāo)準(zhǔn)液于6支試管中,加1.0 mol/L鹽酸溶液補(bǔ)至200 μL(200 μL鹽酸溶液為空白對(duì)照),再加入3.8 mL 8%的三氯乙酸溶液(W/V,蒸餾水溶解),搖勻后加入1.0 mL Ⅱ液,充分混勻室溫下靜置20 min,360 nm處測得吸光值A(chǔ)1。將Ⅱ液換為Ⅰ液重復(fù)上述操作,測得吸光值A(chǔ)2。以硫酸根濃度為橫坐標(biāo),A1-A2差值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7.2 SPSP取代度測定 取10 mg SPSP粉末于試管中,加入1.0 mL 1.0 mol/L鹽酸溶液并于沸水浴中反應(yīng)5 h,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線中的方法測定硫酸基取代度,并按以下公式計(jì)算:

式中:S為SPSP1-A中硫酸根離子含量,%;C為SPSP1-A溶液濃度,mg/mL;V為SPSP1-A溶液體積,mL;W為SPSP1-A粉末質(zhì)量,mg。

1.2.7.3 羧甲基化取代度的測定 根據(jù)Wang等[19]的方法,稱取CPSP粉末50 mg置于燒杯中,加入0.1 mol/L鹽酸溶液2.0 mL,并攪拌混勻,使多糖完全溶解,再用0.1 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行滴定,根據(jù)pH達(dá)到2.1和4.3時(shí)所需堿液體積V1、V2,按以下公式計(jì)算取代度,公式如下:

式中:M為CPSP1-A質(zhì)量,g;C為NaOH濃度,mol/L。

1.2.8 紅外光譜分析 分別取PSP1-A、SPSP1-A、CPSP1-A粉末各10 mg,鼓風(fēng)干燥箱中40 ℃烘干24 h,將樣品粉末與適量溴化鉀晶體混合,在瑪瑙研缽中研磨均勻,壓成1 mm薄片,使用紅外光譜儀測定4000～400 cm-1波段樣品的紅外吸收。

1.2.9 抗氧化活性測定

1.2.9.1 清除DPPH自由基能力 根據(jù)Eskandari等[20]的方法稍作改動(dòng),取5支潔凈試管,依次向其中加入1.0×10-4mol/L的DPPH-乙醇溶液2.0 mL,0.2 mol/L pH=7.0的磷酸鹽緩沖液1.0 mL,待測樣品(2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/mL)2.0 mL?；靹蚝笫覝叵卤芄馓幏磻?yīng)30 min,在517 nm處測得反應(yīng)后吸光值A(chǔ)1,以無水乙醇代替DPPH得到吸光值A(chǔ)2,以蒸餾水代替多糖樣品溶液得到吸光值A(chǔ)0,并以稀釋100倍的VC溶液(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)作陽性對(duì)照。

DPPH自由基清除率計(jì)算公式:

式中:A1為不同濃度樣品(PSP1-A、SPSP1-A、CPSP1-A、VC)溶液的吸光值;A2為無水乙醇代替DPPH的參比對(duì)照吸光值;A0為蒸餾水代替樣品的空白對(duì)照吸光值。

1.2.9.2 清除ABTS自由基能力 根據(jù)Wootton-Beard等[21]的實(shí)驗(yàn)方法稍作改動(dòng),取10.0 mL ABTS溶液(7.0 mmol/L)與10.0 mL過硫酸鉀溶液(15.0 mmol/L)混勻,在4 ℃冰箱中避光反應(yīng)16 h,實(shí)驗(yàn)前用pH=7.4的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋,使反應(yīng)液的吸光值在734 nm處達(dá)到0.70±0.02,得到ABTS工作液。取5支潔凈試管,依次向其中加入ABTS工作液2.0 mL,待測樣品(2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/mL)0.2 mL,混合均勻,室溫下避光反應(yīng)20 min,測定734 nm處吸光值A(chǔ)1,以蒸餾水代替多糖樣品得到吸光值A(chǔ)0,并以稀釋100倍的VC溶液(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)作陽性對(duì)照。

ABTS自由基清除率計(jì)算公式:

式中:A1為不同濃度樣品(PSP1-A、SPSP1-A、CPSP1-A、VC)溶液的反應(yīng)后吸光值;A0為蒸餾水空白組吸光值。

1.2.9.3 清除羥基自由基能力 采用水楊酸比色法,根據(jù)侯令[22]的研究稍作改動(dòng),取5支潔凈試管,依次向其中加入9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.5 mL,待測樣品(2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/mL)2.0 mL,9.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液0.5 mL,蒸餾水6.5 mL,最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液0.5 mL,在37 ℃恒溫水浴鍋中水浴反應(yīng)30 min,測定510 nm處吸光值A(chǔ)1,以蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液得到吸光值A(chǔ)2,取蒸餾水代替樣品測得吸光值A(chǔ)3,并以稀釋100倍的VC溶液(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)作陽性對(duì)照。

羥基自由基清除率計(jì)算公式:

式中:A1為不同濃度樣品(PSP1-A、SPSP1-A、CPSP1-A、VC)溶液的反應(yīng)后吸光值;A2為蒸餾水取代亞鐵離子的吸光值;A3為蒸餾水空白組吸光值。

1.2.9.4 總還原力 參照張榮華[23]的研究稍作調(diào)整,取5支潔凈試管,依次向其中加入1%鐵氰化鉀溶液(W/V)1.0 mL,pH=6.6的磷酸鹽緩沖液1.0 mL,待測樣品(2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/mL)1.0 mL,混勻后于恒溫水浴鍋中50 ℃保溫20 min。再向反應(yīng)液中加入10%三氯乙酸溶液(W/V)1.0 mL,混勻后4000 r/min離心10 min去除沉淀,取上清液2.0 mL,再依次加入蒸餾水1.0 mL,0.1%氯化鐵溶液(W/V)0.4 mL,室溫下反應(yīng)10 min后于700 nm處測定反應(yīng)液吸光值。以稀釋100倍的VC溶液(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)作陽性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以去除實(shí)驗(yàn)誤差,數(shù)據(jù)處理運(yùn)用Origin Pro 8.0及SPSS 19.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精多糖含量

采用苯酚-硫酸法測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖1),線性回歸方程為y=0.0643x+0.0041,R2=0.9978,測得黃精的多糖含量為(18.65%±0.04%)。

圖1 多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of polysaccharide concentration

2.2 黃精多糖的純化

2.2.1 DEAE-52纖維素柱層析 黃精粗多糖以蒸餾水、0.2和0.5 mol/L NaCl為洗脫液,經(jīng)過陰離子交換層析柱,分離得到三個(gè)洗脫峰。第一個(gè)洗脫峰為蒸餾水洗脫峰,從第6管開始收集一直到第18管,洗脫液濃縮醇沉凍干后得到多糖粉末,記為PSP1;第二個(gè)洗脫峰為0.2 mol/L NaCl溶液洗脫得到的的單峰,收集第24～34管洗脫液,凍干后得到多糖粉末記為PSP2;第三個(gè)洗脫峰為0.5 mol/LNaCl溶液洗脫得到的單峰,收集46～48管洗脫液記為PSP3。重復(fù)操作,富集得率最大的蒸餾水洗脫組分用于后續(xù)純化。

圖2 DEAE-52纖維素離子交換層析Fig.2 DEAE-52 column chromatogram

2.2.2 葡聚糖凝膠層析 以蒸餾水為洗脫液進(jìn)一步純化DEAE-52分離所得多糖PSP1,得到洗脫曲線如圖3。由圖可知,凝膠柱洗脫得單一峰,收集5～16管洗脫液得到凍干多糖粉末,記為PSP1-A,重復(fù)操作,富集純化多糖PSP1-A。

圖3 Sephadex G-200層析洗脫曲線Fig.3 Sephadex G-200 column chromatogram

2.3 黃精多糖純度鑒定

2.3.1 PSP1-A的紫外全波長掃描分析 PSP1-A的紫外全波長掃描圖如圖4所示。由圖譜可知,黃精多糖純化組分PSP1-A在260 nm和280 nm處無吸收峰,說明不含核酸和蛋白質(zhì)成分,表明粗多糖的除雜效果較好。

圖4 PSP1-A的紫外可見全波長掃描曲線圖Fig.4 UV-visible full spectrum scan of PSP1-A

2.3.2 PSP1-A的分子量測定 本實(shí)驗(yàn)測得的黃精多糖分子量結(jié)果如下,數(shù)均分子量(Mn)為12.83 kDa,重均分子量(Mw)為21.58 kDa,分布寬度指數(shù)PD為1.68,其PD值在小于1.8,這說明黃精多糖分散性雖大但分布均勻。劉娜[4]分離得到四種黃精多糖組分,分子量相差很大,Mw在2.24～7.74 kDa范圍內(nèi),其結(jié)果均小于本實(shí)驗(yàn)測得的分子量。

表1 PSP1-A 的分子量分布特性Table 1 Molecular characterization of PSP1-A

2.4 取代度(DS)的測定

2.4.1 硫酸基取代度的測定 以硫酸根離子濃度為橫坐標(biāo),A1-A2差值為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖5),線性回歸方程為y=0.7357x-0.01122,R2=0.9961,將SPSP1-A的吸光值帶入公式中,得到其硫酸基含量為14.93%,取代度為1.44。

圖5 硫酸基含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of sulfonic acid content

2.4.2 羧甲基化取代度的測定 利用黃精多糖在堿性條件下與一氯乙酸反應(yīng)的方法制得羧甲基化黃精多糖,根據(jù)公式計(jì)算出CPSP1-A的取代度為0.49。

2.5 紅外光譜分析

圖6 PSP1-A、SPSP1-A、CPSP1-A的紅外光譜Fig.6 Infrared spectra of PSP1-A,SPSP1-A and CPSP1-A

修飾前PSP1-A及修飾后SPSP1-A、CPSP1-A的紅外光譜圖分別如圖6所示。PSP1-A存在多糖特征吸收峰,分別在3424、2934、1640、1423、1377、1128、1029、879和809 cm-1處有特征峰。在3424 cm-1處有典型較寬的大拉伸峰,表明存在分子間的O-H伸縮振動(dòng);2934 cm-1的特征吸收峰與飽和C-H鍵伸縮振動(dòng)有關(guān)[24];1640 cm-1處是由-OH彎曲振動(dòng)引起的;1423、1377 cm-1處存在=CH2變形吸收峰[25]。研究表明1200～1000 cm-1區(qū)間內(nèi)的特征峰與C-O-C及C-O-H的伸縮振動(dòng)有關(guān)[26],該多糖在1128、1029 cm-1處有羧基C-O的伸縮振動(dòng),證明該多糖為吡喃糖[27]。多糖在879 cm-1處存在特征吸收峰,且在(840±8) cm-1處未出現(xiàn)特征吸收峰,判斷該多糖可能主要是β-型異構(gòu)體。與PSP1-A相比,SPSP1-A除具備類似PSP多糖的特征吸收峰外,在1260、812 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰,分別為不對(duì)稱S=O伸縮振動(dòng)及C-O-S拉伸振動(dòng)引起的吸收峰[28],說明羥基上有硫酸酯基,硫酸化修飾成功。CPSP1-A多糖在保留3415 cm-1附近O-H伸縮振和2930 cm-1附近C-H鍵伸縮振動(dòng)等特征吸收峰的同時(shí),在1604 cm-1處出現(xiàn)-COOCH3的C-H變角振動(dòng)引起的特征吸收峰,在1328 cm-1處出現(xiàn)C=O對(duì)稱收縮振動(dòng)引起的特征吸收峰[29],由此證明CPSP多糖中羧甲基(-CH2COOH)基團(tuán)的存在,羧甲基化修飾成功。

2.6 抗氧化活性檢測

2.6.1 清除DPPH自由基的能力 黃精多糖修飾前后對(duì)DPPH自由基的清除作用如圖7所示。

圖7 PSP1、SPSP1和CPSP1對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging capacity of PSP1,SPSP1 and CPSP1 on DPPH free radicals

DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)是常用的體外評(píng)估抗氧化活性的方法之一,抗氧化劑通常通過提供電子或氫原子來中和DPPH自由基,使DPPH在517 nm處發(fā)生顏色變化,由紫色變?yōu)闇\黃色。由圖7可知,隨著反應(yīng)濃度的增加,4種物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除率均隨著反應(yīng)濃度的增加而增加,且清除DPPH自由基的能力均弱于稀釋100倍濃度的VC,通過SPSS軟件計(jì)算可得SPSP1-A、CPSP1-A、PSP1-A的EC50值分別為2.68、1.33和4.72 mg/mL。結(jié)合EC50值綜合考慮,硫酸化及羧甲基化均能提高PSP1-A清除DPPH自由基的能力。文獻(xiàn)中,將黑木耳多糖進(jìn)行羧甲基化修飾,修飾后多糖的DPPH自由基清除率提高16.65%[10],青錢柳多糖硫酸化后清除作用也顯著增強(qiáng),多糖濃度為0.25 mg/mL時(shí),其清除率最高可達(dá)到88.09%,遠(yuǎn)強(qiáng)于黃精多糖的自由基清除率[13]。多糖可為DPPH自由基提供電子,使一系列自由基反應(yīng)終止,其抗氧化活性可能與多糖及結(jié)構(gòu)組成等因素相關(guān)。

2.6.2 清除ABTS自由基的能力 黃精多糖修飾前后對(duì)ABTS自由基的清除作用如圖8所示。

圖8 PSP1、SPSP1和CPSP1對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.8 Scavenging capacity of PSP1,SPSP1 and CPSP1 on ABTS free radicals

ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)是常用的間接抗氧化能力測定方法,氧化后的藍(lán)綠色自由ABTS+可被抗氧化劑還原而褪色。由圖7可知,自由基清除率與所測樣品濃度之間存在劑量依賴關(guān)系,隨濃度增大清除率增大。通過SPSS軟件計(jì)算可得SPSP1-A、CPSP1-A、PSP1-A的EC50分別為1.52、2.33和2.26 mg/mL,清除ABTS自由基的能力均強(qiáng)于濃度稀釋100倍的VC。各濃度下CPSP1-A清除率小于PSP1-A,說明羧甲基化修飾后,清除ABTS自由基的能力能力減弱,其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。研究表明黑木耳羧甲基化衍生物的ABTS+清除率增加,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異。

2.6.3 清除羥基自由基的能力 黃精多糖修飾前后對(duì)羥基自由基的清除作用如圖9所示。

圖9 PSP1、SPSP1和CPSP1對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.9 Scavenging capacity of PSP1,SPSP1 and CPSP1 on hydroxyl radicals

羥基自由基是可以輕易穿過細(xì)胞膜造成細(xì)胞死亡的高效氧化劑,因此在研究多糖對(duì)羥基自由基的清除能力具有重要意義。圖9顯示,SPSP1-A、CPSP1-A、PSP1-A清除·OH的能力與濃度呈正相關(guān),通過SPSS軟件計(jì)算可得SPSP1-A、CPSP1-A、PSP1-A的EC50分別為2.65、1.65和3.10 mg/mL,結(jié)果表明硫酸化、羧甲基化修飾均能增強(qiáng)PSP1-A的·OH清除活性。青錢柳硫酸化多糖對(duì)羥基自由基的清除作用顯著增強(qiáng),IC50最低值為0.24 mg/mL,遠(yuǎn)低于硫酸化黃精多糖,而青錢柳多糖的半抑制濃度為4.71 mg/mL[13],活性低于黃精多糖PSP1-A。

2.6.4 還原力 黃精多糖修飾前后還原力變化如10所示。

圖10 PSP1、SPSP1和CPSP1還原力測定Fig.10 Reducing power assay of PSP1,SPSP1 and CPSP1

實(shí)驗(yàn)采用鐵氰化鉀還原法來測定樣品的電子供給能力,抗氧化劑可將Fe3+復(fù)合物還原,從而評(píng)估待測樣品的潛在抗氧化活性。如圖10所示,所有多糖樣品的還原能力均低于濃度縮小100倍的VC。PSP1-A還原力最弱,最大濃度10.00 mg/mL時(shí),還原力為0.299,與PSP1-A相比,羧甲基修飾多糖的還原力略微增加為0.468,此時(shí)SPSP1-A還原力為0.910,遠(yuǎn)高于羧甲基修飾結(jié)果,約為PSP1-A還原力的三倍。結(jié)果表明羧甲基化修飾可一定程度上提高黃精多糖的還原力,硫酸化修飾能顯著增加PSP1-A的還原力,所有多糖樣品的還原能力均低于VC。這些變化可能與修飾改變多糖空間結(jié)構(gòu)等因素相關(guān)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以黃精多糖為研究對(duì)象,超聲提取的粗多糖,經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析對(duì)脫蛋白后黃精多糖進(jìn)行分離,富集含量較高的蒸餾水洗脫組分PSP1過葡聚糖凝膠柱后得到均一組分PSP1-A,紫外光譜證實(shí)不含蛋白質(zhì)及核酸,平均分子量為21.58 kDa。純化后進(jìn)行硫酸化及羧甲基化修飾,得到SPSP1-A、CPSP1-A兩個(gè)修飾產(chǎn)物,取代度(DS)值分別為1.44、0.49。傅里葉紅外光譜分析表明兩種產(chǎn)物均有多糖特征吸收峰,且SPSP1-A成功引入硫酸酯基,CPSP1-A中也存在羧甲基。體外抗氧化活性研究顯示,相同劑量下,SPSP1-A和CPSP1-A清除DPPH、羥基自由基的能力比PSP1-A更顯著,還原力也強(qiáng)于PSP1-A。此外,與PSP1-A、CPSP1-A相比,取代度更高的SPSP1-A對(duì)以上四個(gè)抗氧化指標(biāo)的作用更顯著。本實(shí)驗(yàn)表明硫酸化和羧甲基修飾是增強(qiáng)抗氧化活性的有效方法,這可能與硫酸基、羧甲基官能團(tuán)的引入以及引入基團(tuán)取代度的不同導(dǎo)致的空間變化有關(guān),從而拓寬多糖及其化學(xué)修飾衍生物的生物學(xué)應(yīng)用。