,2,2,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

目前制備蛋白胨多采用酶解的方法,目前制備蛋白胨多以單酶水解的方式,如王錫念[19]等利用風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶水解鮟鱇魚皮,所選取的風(fēng)味蛋白酶具有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶兩種特性,因此酶切位點(diǎn)會(huì)更多,效果更好;堿性蛋白酶是內(nèi)切蛋白酶,其主要酶切位點(diǎn)為Tyr、Phe、Trp[20-21]。有報(bào)道表明復(fù)合酶解效果高于單酶解,復(fù)合酶解包括復(fù)合酶分段水解和復(fù)合酶組合水解[22]。

本實(shí)驗(yàn)用南極磷蝦副產(chǎn)物作為原料,利用風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶分段水解制備蛋白胨,以水解率的大小作為衡量蛋白胨的得率的指標(biāo)。利用風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶分段水解,對(duì)比考察溫度、復(fù)合酶比、時(shí)間、pH(為了簡(jiǎn)化工藝,整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中保持pH不變)對(duì)水解率的影響,對(duì)比大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌在南極磷蝦蛋白胨、牛肉膏蛋白胨上的生長(zhǎng)情況,測(cè)定其OD600,并繪制生長(zhǎng)曲線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 捕撈于南極海域FAO48.2區(qū),南極磷蝦副產(chǎn)物包括南極磷蝦的蝦殼、蝦足、蝦頭等,儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱冷凍備用;風(fēng)味蛋白酶(酶活為2000000 U)、堿性蛋白酶(酶活為2000000 U) 無(wú)錫亨捷未央貿(mào)易有限公司;大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球 上海海洋大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室;甲醛(36%～38%)、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸溶液 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)。

超聲波清洗器(KQ5200E) 上海一恒儀器有限公司;高壓滅菌鍋(LDZF-30KB-III) 上海四科儀器設(shè)備有限公司;高速冷凍離心機(jī)(H2050R) 長(zhǎng)沙湘儀有限公司;凱氏定氮儀(K06) 上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司;無(wú)菌操作臺(tái)(SZX-1) 上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠;氨基酸自動(dòng)分析儀(L-8800) 日本日立公司;紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南極磷蝦副產(chǎn)物制備蛋白胨工藝流程 南極磷蝦副產(chǎn)物→解凍→加水均質(zhì)(1∶4)→復(fù)合酶分段保溫水解(先加入堿性蛋白酶,水解一定時(shí)間后再加入風(fēng)味蛋白酶)[22]→滅酶(100 ℃,30 min)→冷卻→離心(10000 r/min,30 min)→抽濾→南極磷蝦酶解液→凍干(-80 ℃,36 h)→南極磷蝦蛋白胨

1.2.2 加入風(fēng)味蛋白酶時(shí)間的確定 準(zhǔn)確稱取10 g解凍后的南極磷蝦副產(chǎn)物,與蒸餾水1∶4比例混合并均質(zhì)。先加入堿性蛋白酶,分別在超聲水解0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h后,再加入風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)水解。堿性蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶為1∶1,總加酶量為1%,調(diào)節(jié)pH為至7.0,超聲功率40 kHz溫度50 ℃。整個(gè)反應(yīng)時(shí)間為5.0 h后,100 ℃滅酶,靜置冷卻,10000 r/min的條件下離心30 min,比較最終水解率,以確定加入風(fēng)味蛋白酶最適時(shí)間。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取10 g解凍后的南極磷蝦副產(chǎn)物,與蒸餾水1∶4比例混勻、均質(zhì)。調(diào)節(jié)pH為至7.0,溫度50 ℃,在超聲功率為40 kHz下超聲,先加入堿性蛋白酶,經(jīng)上文1.2.2方法確定時(shí)間后再加入風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)水解。堿性蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶為1∶1,總加酶量為1%,整個(gè)反應(yīng)時(shí)間為5.0 h后,100 ℃滅酶,靜置冷卻后,10000 r/min離心30 min,測(cè)定氨基酸態(tài)氮的含量,依次考察溫度、時(shí)間、復(fù)合酶比、pH對(duì)水解率的影響。

設(shè)定單因素的水平依次為溫度(40、45、50、55、60、65 ℃),整個(gè)反應(yīng)時(shí)間(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 h),復(fù)合酶比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3),pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)。

1.2.4 酶解工藝的正交實(shí)驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以水解率為考察指標(biāo),對(duì)水解溫度、時(shí)間、復(fù)合酶比和pH等影響因素進(jìn)行綜合考察,采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化南極磷蝦副產(chǎn)物的水解工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1 酶解工藝的正交試驗(yàn)因素水平設(shè)定Table 1 Factors and levels for orthogonalexperiment of enzymatic hydrolysis

1.2.5 水解率的測(cè)定 水解率的計(jì)算公式為:

氨基酸態(tài)氮:根據(jù)GB5009 235-2016,測(cè)定南極磷蝦蛋白胨中氨基酸態(tài)氮的含量?？偟?采用GB 5009.5-2016凱氏定氮法。利用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定南極磷蝦副產(chǎn)物(蝦殼、蝦足等均質(zhì)后混勻)中總氮量[23]。

1.2.6 南極磷蝦蛋白胨中游離氨基酸的種類及含量 根據(jù)GB/T 5009.124-2003處理樣品,用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定南極磷蝦蛋白胨中的游離氨基酸種類及含量。

1.2.7 南極磷蝦蛋白胨培養(yǎng)微生物的最適濃度 選取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 g/L濃度的南極磷蝦蛋白胨溶液為培養(yǎng)基,以1%的接種量,分別接種大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus),測(cè)定其OD600,確定每種微生物生長(zhǎng)的最適濃度。

1.2.8 牛肉膏蛋白胨、南極磷蝦蛋白胨微生物培養(yǎng)的效果比較 將大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)菌種活化后,以1%的接種量,分別接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中和南極磷蝦蛋白胨(濃度根據(jù)1.2.7中確定)培養(yǎng)基中,在37 ℃的條件下,恒溫培養(yǎng)24.0 h,每間隔2.0 h取一次菌液,以未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、南極磷蝦蛋白胨培養(yǎng)基為空白對(duì)比,測(cè)定OD600值,以O(shè)D600為縱坐標(biāo),以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),分別繪制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨和南極磷蝦蛋白胨上的生長(zhǎng)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Excel 2016和SPSS Statistics 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加入風(fēng)味蛋白酶時(shí)間的確定

從圖1可以看出,加入堿性蛋白酶后,若水解時(shí)間少于1.5 h就加入風(fēng)味蛋白酶,則水解率較小;若在1.5 h后加入風(fēng)味蛋白酶,則水解率較高且波動(dòng)不大。因此確定加入風(fēng)味蛋白酶的適宜時(shí)間為1.5 h。

圖1 加入風(fēng)味蛋白酶的時(shí)間對(duì)水解率的影響Fig.1 Effect of time of adding flavor protease on hydrolysis rate

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 溫度對(duì)水解率的影響 由圖2可知,當(dāng)溫度小于60 ℃時(shí),水解率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),溫度大于60 ℃時(shí)水解率趨于平穩(wěn)且略有下降,在60 ℃時(shí)水解率最高。風(fēng)味蛋白酶的有效反應(yīng)溫度是30～60 ℃,堿性蛋白酶的有效反應(yīng)溫度是40～60 ℃[22],堿性蛋白酶的有效反應(yīng)溫度范圍較風(fēng)味蛋白酶小,兩種蛋白酶有效反應(yīng)的最高溫度為60 ℃,選擇溫度不宜大于60 ℃,所以選擇40、45、50、55、60 ℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖2 溫度對(duì)水解率的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis rate

2.2.2 水解時(shí)間對(duì)水解率的影響 由圖3可知,水解時(shí)間小于5 h時(shí),水解率隨水解時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)水解時(shí)間大于5 h后,水解率變化較為緩慢且略有下降。從時(shí)間和能耗耗方面考慮,繼續(xù)酶解會(huì)增加成本,反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可能因起蛋白酶變性,所以選擇3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 水解率隨時(shí)間的變化Fig.3 Hydrolysis rate change with time

2.2.3 復(fù)合酶比對(duì)水解率的影響 由圖4可知,在風(fēng)味蛋白酶∶堿性蛋白酶=3∶1、2∶1、1∶2、1∶3條件下進(jìn)行水解,其水解率均小于風(fēng)味蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶1時(shí)的水解率。因此,適宜的水解復(fù)合酶比為1∶1。

圖4 復(fù)合酶比對(duì)水解率的影響Fig.4 Effect of complex enzyme ratio on hydrolysis rate

圖5 pH對(duì)水解率的影響Fig.5 Effect of pH on hydrolysis rate

2.2.4 pH對(duì)水解率的影響 由圖5可知,隨著pH的升高,水解率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在pH=5.0時(shí)水解率最高。堿性蛋白酶適宜的pH范圍6.0～10.0,風(fēng)味蛋白酶適宜的pH范圍5.0～9.0,風(fēng)味蛋白酶作用的適宜pH較堿性蛋白酶低,經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶作用后,為風(fēng)味蛋白酶提供了更多底物,低pH更有利于風(fēng)味蛋白酶的作用,本實(shí)驗(yàn)適宜的水解pH為5.0。

2.3 酶解工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知,各個(gè)因素對(duì)水解率影響的大小順序?yàn)?A>C>D>B。酶解工藝的最佳組合為A5B5C3D1,即溫度60 ℃、時(shí)間5 h、復(fù)合酶比1∶1、pH=5.0,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得出的最大水解率為28.38%。由表3酶解工藝方差分析表可以得出,酶解溫度對(duì)水解率有顯著性影響(P<0.05)。

表2 酶解工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment of enzymatic hydrolysis

表3 酶解工藝的方差分析Table 3 Analysis of variance of enzymatic hydrolysis

注:*:表示差異顯著,P<0.05。

表4 南極磷蝦蛋白胨中游離氨基酸的種類及含量Table 4 Types and contents of free aminoacids in antarctic krill peptone

2.4 南極磷蝦蛋白胨中游離氨基酸組成及含量

測(cè)定南極磷蝦蛋白胨中游離氨基酸的種類和含量如表4所示。南極磷蝦蛋白胨含有17種游離氨基酸,總游離氨基酸含量為(2968.83±35.1) mg/100 g。

2.5 南極磷蝦蛋白胨培養(yǎng)微生物的最適濃度

由圖6可知隨著南極磷蝦蛋白胨濃度逐漸增加,微生物的OD600值為遞增趨勢(shì),當(dāng)?shù)竭_(dá)某一濃度,OD600值較穩(wěn)定。當(dāng)培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌的南極磷蝦蛋白胨培養(yǎng)基濃度分別為3.5、5.0、4.0、4.5 g/L時(shí),OD600值最大,大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)速率最高,因此培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌的最適濃度分別為3.5、5.0、4.0、4.5 g/L。

圖6 南極磷蝦蛋白胨溶液培養(yǎng)微生物的適宜濃度Fig.6 Suitable concentration of culturingmicroorganisms in antarctic krill peptone solution

2.6 微生物培養(yǎng)效果比較

2.6.1 大腸桿菌(E.coli)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 圖7為大腸桿菌在牛肉膏蛋白胨、南極磷蝦蛋白胨上的生長(zhǎng)曲線,在0～7 h處于延滯期,生長(zhǎng)較慢、分裂遲緩。在8～14 h生長(zhǎng)速度比較快,這時(shí)的大腸桿菌生長(zhǎng)速率最快,這個(gè)階段屬于對(duì)數(shù)期,這個(gè)時(shí)期的的菌株最適宜做微生物接種的種菌。15 h之后大腸桿菌的菌體數(shù)量達(dá)到平穩(wěn),菌落群數(shù)最多,這個(gè)階段為穩(wěn)定期,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少,活的細(xì)胞數(shù)目較多。測(cè)得大腸桿菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600僅比在南極磷蝦蛋白胨中大0.077左右。

圖7 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.7 The growth curve of E.coli

2.6.2 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 圖8金黃色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨、南極磷蝦蛋白胨上的生長(zhǎng)曲線,在0～8 h處于延滯期,生長(zhǎng)比較慢。在10～14 h生長(zhǎng)速度比較快,這時(shí)的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)速率最快,這個(gè)時(shí)期為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,這個(gè)時(shí)期的的菌株最適宜做微生物接種的種菌。14 h菌落總數(shù)最多,這個(gè)時(shí)期為穩(wěn)定期,在這個(gè)時(shí)期培養(yǎng)基中微生物賴以生存的營(yíng)養(yǎng)成分減少、微生物會(huì)產(chǎn)生有毒有害成分。測(cè)得金黃色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600僅比在南極磷蝦蛋白胨中大0.08左右。

圖8 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線Fig.8 The growth curve of Staphylococcus aureus

2.6.3 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 圖9為枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨、南極磷蝦蛋白胨上的生長(zhǎng)曲線,0～7 h處于延滯期,分裂遲緩。在8～14 h生長(zhǎng)速度比較快,這時(shí)的枯草芽孢桿生長(zhǎng)速率最快,這個(gè)階段屬于對(duì)數(shù)期,這個(gè)時(shí)期的的菌株最適宜做微生物接種的種菌。15 h之后枯草芽孢桿菌的菌體數(shù)量達(dá)到平穩(wěn),菌落群數(shù)最多,這個(gè)階段為穩(wěn)定期,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被減少,活的細(xì)胞數(shù)目較多。測(cè)得枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600僅比在南極磷蝦蛋白胨中大0.076左右。

圖9 枯草芽孢桿生長(zhǎng)曲線Fig.9 The growth curve of Bacillus subtilis

2.6.4 蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 圖10為蠟狀芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨、南極磷蝦蛋白胨上的生長(zhǎng)曲線,在0～9 h處于延滯期內(nèi)生長(zhǎng)比較慢。在10～14 h生長(zhǎng)速度比較快,這時(shí)蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)速率最快,這個(gè)時(shí)期為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,這個(gè)時(shí)期的的菌株最適宜做微生物接種的種菌。14 h之后處于穩(wěn)定期,活細(xì)胞數(shù)目最多,在這個(gè)時(shí)期培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)開(kāi)始減少、并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類,降低pH,菌體會(huì)生成一些有毒有害物質(zhì),導(dǎo)致之后會(huì)出現(xiàn)菌體自溶等現(xiàn)象。測(cè)得蠟狀芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600僅比在南極磷蝦蛋白胨中大0.089左右。

圖10 蠟狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線Fig.10 The growth curve of Bacillus cereus

3 結(jié)論

以南極磷蝦副產(chǎn)物為原料,利用風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶分段水解制備蛋白胨,最佳酶解工藝條件為:溫度60 ℃、pH5.0、加入堿性蛋白酶水解1.5 h后,再加入風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)水解解3.5 h,復(fù)合酶比1∶1,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),水解率為28.38%,得到的南極磷蝦蛋白胨富含17種游離氨基酸,總游離氨基酸含量為(2968.83±35.1) mg/100 g。以南極磷蝦蛋白胨溶液為培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌的最適濃度分別為3.5、5.0、4.0、4.5 g/L,其在此濃度下OD600值最大,生長(zhǎng)速率最高。測(cè)得4種微生物在牛肉膏蛋白胨中的OD600僅比在南極磷蝦蛋白胨中大8%左右,說(shuō)明南極磷蝦蛋白胨可以替代牛肉膏蛋白胨作為微生物培養(yǎng)基的成分。本文為南極磷蝦副產(chǎn)物的綜合利用提供了一定的理論依據(jù)。