吳西軍， 姚冬靜， 劉慶， 楊小燕， 王念雪， 王一慧， 舒莉萍， 何志旭**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細胞實驗中心, 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550004； 3.河北省人民醫(yī)院 兒科, 河北 石家莊 050057； 4.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 貴州 貴陽 550004； 5.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 兒童血液腫瘤科, 貴州 貴陽 550004)

造血干細胞移植 (hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是一些難治性疾病、特別是血液系統(tǒng)惡性疾病的首選治療方法，由于HSCT治療需要相當數(shù)量的細胞，因此研究造血干細胞 (hematopoietic stem cell，HSC) 的自我更新、增殖、分化的機制，以解決HSC來源不足的問題顯得尤為重要。斑馬魚的造血過程和哺乳動物一樣高度保守，可分為原始造血和定向造血，隨著胚胎的發(fā)育，原始造血進入以主動脈-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonephros，AGM)區(qū)和前腎為標志的定向造血，最早的定向HSC在此出現(xiàn)[1-3]。在體外高表達hoxb4可以增強胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)的造血潛能，并且能促進ESC向粒系、單核、巨核系集落生成細胞和紅系集落分化[4]。有研究顯示，骨髓細胞在導(dǎo)入hoxb4基因后，HSC擴增能力大大增強，與對照組比較可以達50倍以上，并且這種擴增不伴隨外周血細胞形態(tài)和比例的改變及功能的異常[5-6]。本課題組前期建立了在原始造血階段可以時空和組織特異性高表達的、穩(wěn)定的、可示蹤的hoxb4轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，且斑馬魚胚胎尾部動靜脈血管網(wǎng)處可見血流緩慢，甚至瘀滯成團的現(xiàn)象[7-9]，基于這些前期研究結(jié)果，考慮作為血管內(nèi)皮黏附分子的cdh5可能參與了hoxb4引起的HSC的增殖過程，故本研究以hoxb4基因高表達的轉(zhuǎn)基因斑馬魚為模型，研究hoxb4基因高表達時cdh5基因在定向造血階段表達的時空變化，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1實驗動物 實驗動物包括野生型(wild type，WT)斑馬魚系(shanghai)，增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚系(TG∶zLmo2-LDeL-EGFP)，hoxb4轉(zhuǎn)基因斑馬魚系(TG∶zLmo2-LDeL-hoxb4-EGFP)和轉(zhuǎn)基因工具魚斑馬魚系(TG:zLmo2-Cre)。轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系由lmo2啟動子驅(qū)動，可特異性識別，條件性進行剪切，使hoxb4-EGFP或者EGFP得以表達，WT及轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚均由細胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室繁育[7]。飼養(yǎng)方法：28 ℃循環(huán)系統(tǒng)飼養(yǎng)，每天光照與黑暗各半, 雌雄比1 ∶2交配，收集受精卵于28 ℃胚胎孵化液中，每天半換液，5～7 d后開始喂食草履蟲。

1.1.2主要試劑與儀器pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒由細胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室構(gòu)建并鑒定，限制性內(nèi)切酶購自加拿大Fermentas公司，地高辛RNA標記及檢測試劑盒和NucAwayTM SPin Columns購自美國Ambion公司，質(zhì)粒小抽試劑盒購自美國Axygen公司，DNA凝膠回收試劑盒購自上海申能生物公司，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/硝基四氮唑藍堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自美國VECTOR Lab 公司，體視顯微鏡及正置顯微鏡購自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1制備cdh5反義mRNA探針 用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ將pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒線性化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并割膠回收；以線性化的質(zhì)粒為模板，加入地高辛標記的寡核苷酸，T7 RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)NucAwayTM Spin Columns純化吸附柱回收后，得到cdh5基因反義mRNA探針，探針經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進行定性分析，分裝后-70 ℃保存。

1.2.2斑馬魚定向造血階段胚胎全胚胎原位雜交和測定 實驗分為WT對照組、EGFP對照組、高表達hoxb4實驗組，各組收集發(fā)育至32、36、40、44、48 hpf(hours post-fertilization)斑馬魚胚胎各30枚；4%多聚甲醛固定，4 ℃輕搖過夜，經(jīng)脫水、再水化、蛋白酶K處理及胚胎再固定處理；68 ℃預(yù)雜交15 min，加入地高辛標記的cdh5反義mRNA探針，雜交爐中過夜；去除探針洗滌3次，30 min/次；封閉非特異性位點，加抗地高辛抗體，4 ℃輕搖過夜；加入NBT/BCIP染液染色，4%多聚甲醛固定，4 ℃保存過夜，體視顯微鏡拍照。選用同批次同光源強度下攝像的10個胚胎的圖像，應(yīng)用軟件Leica Qwin Plus測量灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 cdh5基因32 hpf原位雜交檢測

3組雜交胚胎均可觀察到cdh5-mRNA在造血組織AGM區(qū)、尾部血島(posterior blood island，PBI)有明顯的表達信號，見圖1A；在AGM區(qū)，hoxb4實驗組cdh5-mRNA的表達較EGFP對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但EGFP對照組與WT對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1B；在PBI區(qū)，hoxb4實驗組cdh5-mRNA的表達較EGFP對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但EGFP對照組與WT對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1C。

注：A為cdh5-mRNA全胚胎原位雜交結(jié)果(32 hpf，藍色箭頭表示AGM區(qū)，綠色箭頭表示PBI區(qū))，B為3組胚胎32 hpf-AGM區(qū)的灰度值比較，C為3組胚胎32 hpf-PBI區(qū)的灰度值比較；(1) 與WT對照組比較，P<0.05；(2)與EGFP對照組比較，P<0.05。圖1 3組斑馬魚胚胎32 hpf 時cdh5-mRNA的表達Fig.1 The effect of hoxb4 overexpression on the expression of cdh5-mRNA in 32 hpf zebrafish embryos by whole mount in situ hybridization in three different types

2.2 cdh5基因36 hpf原位雜交檢測

結(jié)果顯示，3組胚胎均可見cdh5-mRNA在造血組織AGM區(qū)和PBI區(qū)均有較高表達，見圖2A；在AGM區(qū)，hoxb4實驗組cdh5-mRNA的表達分別較EGFP對照組和WT對照組增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但EGFP對照組與WT對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2B；在PBI區(qū)，hoxb4實驗組cdh5-mRNA的表達分別較EGFP對照組和WT對照組增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但EGFP對照組與WT對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2C。

注：A為cdh5-mRNA全胚胎原位雜交結(jié)果(36 hpf，藍色箭頭表示AGM區(qū)，綠色箭頭表示PBI區(qū))，B為3組胚胎36 hpf-AGM區(qū)的灰度值比較，C為3組胚胎36 hpf-PBI區(qū)的灰度值比較；(1) 與WT對照組比較，P<0.05；(2)與EGFP對照組比較，P<0.05。圖2 3組斑馬魚胚胎36 hpf時cdh5-mRNA的表達Fig.2 The effect of hoxb4 overexpression on cdh5-mRNA expression in 36 hpf zebrafish embryos by whole mount in situ hybridization

2.3 cdh5基因40 hpf原位雜交檢測

結(jié)果顯示，3組胚胎均可見cdh5-mRNA在造血組織PBI區(qū)(綠色箭頭指示)有表達，見圖3A；hoxb4實驗組cdh5-mRNA的表達分別較EGFP對照組及WT對照組增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；EGFP對照組與WT對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3B。

2.4 cdh5基因44 hpf原位雜交檢測

結(jié)果顯示，3組胚胎均可見cdh5 mRNA在造血組織PBI區(qū)有表達，見圖3A；hoxb4實驗組cdh5-mRNA的表達分別較EGFP對照組及WT對照組增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但EGFP對照組與WT對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3C。

2.5 cdh5基因48 hpf原位雜交檢測

3組胚胎雜交后圖片清晰，cdh5-mRNA在造血組織中無表達，均僅在后腦及血管處有較低豐度的表達。見圖4。

3 討論

造血發(fā)育是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，在大量的內(nèi)源和外源信號精密調(diào)控下進行，如轉(zhuǎn)錄因子、生長因子和細胞周期調(diào)控因子均參與了這個調(diào)節(jié)過程，如：hox、scl、lmo2、runx1、gata1、rag1、flk1等[10-11]。早期造血干/祖細胞的增殖與分化調(diào)控中hox家族最受關(guān)注，其中hoxb4作為第一個確認的正向調(diào)節(jié)因子，尤其受學(xué)者們關(guān)注。hoxb4在HSC自我更新的起始過程中起著非常重要的作用，但到目前為止，hoxb4影響HSC的作用機制仍不十分清楚[12-13]。cdh5分子在造血起始階段的成血血管干細胞上有表達，對造血發(fā)育起重要作用[10]。有研究表明刪除cdh5基因后小鼠胚胎停止在第12.5天，cdh5+的早期造血細胞可以重建造血[14]，可見cdh5參與哺乳動物早期階段造血發(fā)育。

圖4 3組48 hpf斑馬魚胚胎cdh5-mRNA的表達Fig.4 The effect of hoxb4 overexpression on the expression of cdh5-mRNA in 48 hpf zebrafish embryos by whole mount in situ hybridization in three different types

斑馬魚體積小、易于飼養(yǎng)，幼魚期通體透明，造血系統(tǒng)發(fā)育調(diào)控、造血發(fā)育時空表達與哺乳動物一樣都高度保守等特點，使其成為造血發(fā)育領(lǐng)域理想的模式生物[15-17]。斑馬魚的造血發(fā)育時程與哺乳動物類似，分為原始造血和定向造血；其造血時程和造血部位與哺乳動物造血時程和部位有較嚴格的對應(yīng)關(guān)系，因此利用斑馬魚胚胎期通體透明，發(fā)育時程較哺乳動物快的特點，在體連續(xù)觀察研究胚胎期造血發(fā)育變化情況，較體內(nèi)受精、宮內(nèi)發(fā)育的哺乳動物有較大的優(yōu)勢[18-19]。有研究表明斑馬魚胚胎定向造血起始于受精后的第30 h(30 hpf)[20-22]，因此在斑馬魚胚胎受精后30 h以后選取相應(yīng)時間節(jié)點進行定向造血發(fā)育研究是比較合適的階段。

本研究用在造血組織EGFP標記的特異性高表達hoxb4的斑馬魚系為實驗組，與EGFP對照組、WT對照組的定向造血階段不同發(fā)育時相點的胚胎進行全胚胎原位雜交，選取發(fā)育時間節(jié)點為32、36、40、44、48 hpf。結(jié)果顯示32、36 hpf時，hoxb4實驗組造血組織AGM、PBI區(qū)cdh5-mRNA與EGFP對照組及WT對照組的陽性雜交信號有差異，且灰度值測定結(jié)果表明hoxb4實驗組較EGFP對照組及WT型對照組增加，差異增有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，EGFP對照組與WT型對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；40、44 hpf時，3組斑馬魚胚胎造血組織AGM、PBI區(qū)cdh5-mRNA的表達的陽性雜交信號有差異，PBI區(qū)域經(jīng)灰度值測定結(jié)果表明hoxb4實驗組較EGFP對照組及WT型對照組增加，差異增有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，EGFP對照組與WT對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；48 hpf發(fā)育時相節(jié)點，3組斑馬魚胚胎cdh5-mRNA均僅在后腦與血管處有較低豐度的表達，造血部位沒有觀察到cdh5-mRNA的表達,這一結(jié)果提示在原始造血階段高表達hoxb4的情況下，斑馬魚胚胎定向造血區(qū)域cdh5-mRNA表達增加，且高表達hoxb4的胚胎定向造血部位、cdh5表達區(qū)域與EGFP對照組及WT對照組胚胎一致，可能是原始造血階段hoxb4的表達增加，影響了斑馬魚胚胎的原始造血，進而影響到定向造血早期階段造血組織的發(fā)育和分化。因此，本研究考慮在斑馬魚胚胎造血發(fā)育調(diào)控過程中，cdh5基因可能是hoxb4基因的直接或間接靶基因，即hoxb4的高表達，促使cdh5基因表達量增加，以此促進細胞增殖，減少細胞凋亡，從而促進HSC的增殖與發(fā)育。

綜上所述，本研究連續(xù)檢測了轉(zhuǎn)基因模式生物斑馬魚胚胎期定向造血階段造血組織中cdh5-mRNA在不同造血區(qū)域的表達，使得實驗結(jié)果具有時空連續(xù)性；確認了cdh5在斑馬魚造血發(fā)育調(diào)控過程中，會隨著造血發(fā)育正向調(diào)控因子hoxb4表達的變化而變化，在造血時程與區(qū)域位置上嚴格對應(yīng)，且變化明顯。但是由于當前缺乏針對斑馬魚cdh5蛋白的特異性抗體，僅在mRNA水平研究了hoxb4高表達時cdh5在斑馬魚胚胎定向造血階段的變化，尚不能完全反映cdh5作為黏附分子在造血組織的變化，今后需要根據(jù)科學(xué)的發(fā)展作進一步的研究。