張世超， 歐陽(yáng)燕， 蘭應(yīng)武， 唐福州， 胡祖權(quán)， 曾柱

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

mRNA可變剪接是指特定的剪切外顯子被選擇性去除或保留的過(guò)程[1]。pre-mRNA的選擇性加工是產(chǎn)生mRNA亞型的重要機(jī)制，是蛋白多樣性的主要來(lái)源[1-2]，同時(shí)還是調(diào)節(jié)mRNA翻譯效率的主要途徑之一[3]。因此，選擇性剪接是必不可少的生物學(xué)過(guò)程，剪接模式的改變與蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)?；蚪M功能研究結(jié)果顯示，剪接缺陷和特定類型的剪接加工是癌癥的驅(qū)動(dòng)因素[4]。肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致死亡的主要癌癥，主要包括肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD) 和肺鱗狀細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)[5-6]。肺腺癌屬于非小細(xì)胞癌，與肺鱗狀細(xì)胞癌不同，多發(fā)生于女性及不吸煙者，基因組研究表明，肺腺癌基因的拷貝數(shù)、DNA甲基化和基因表達(dá)均與其正常細(xì)胞不同[7]；而且，癌癥特異性的mRNA可變剪接在肺腺癌與其正常細(xì)胞中也呈現(xiàn)明顯的差異[7-8]，但目前肺腺癌中基于可變剪接事件的系統(tǒng)生存分析尚缺乏。以mRNA可變剪接事件構(gòu)建癌癥患者的預(yù)后模型，對(duì)為患者提供個(gè)體化治療具有重要的臨床意義。因此，本研究基于腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，系統(tǒng)分析肺腺癌患者的生存率與mRNA可變剪接之間的關(guān)系，構(gòu)建預(yù)后模型和預(yù)后相關(guān)可變剪接基因的網(wǎng)絡(luò)互作圖，并預(yù)測(cè)、分析預(yù)后相關(guān)可變剪接基因的信號(hào)通路，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcga data.nci.nih.gov/tcga/)下載LUAD隊(duì)列中474例肺腺癌組織的RNA-seq數(shù)據(jù)，并使用Java應(yīng)用程序SpliceSeq v3.2拼接工具分析樣本轉(zhuǎn)錄剪接模式，得到7種類型可變剪接事件的“選擇剪接百分比值”(percent spliced in，PSI)，7種可變剪接事件包括Mutually Exclusive Exons(ME)、Retained Intron(RI)、Alternate Donor site(AD)、Alternate Acceptor site(AA)、 Alternate Terminator(AT)、Alternate Promoter(AP)和 Exon Skip(ES)[9-11]，同時(shí)從TCGA的泛癌圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中提取患者相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、性別和總生存期。

1.2 可變剪接事件檢測(cè)

收集5例肺腺癌患者的癌組織，提取其RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步通過(guò)PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)CHEK1、KIF23、MCM7和FN1 的mRNA亞型條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用R/Bioconductor。單因素Cox回歸分析評(píng)價(jià)可變剪接事件PSI值與肺腺癌患者總生存期之間的關(guān)系并構(gòu)建預(yù)后模型，“survival ROC”繪制受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC)，ROC曲線下面積(area under ROC curve，AUC)評(píng)價(jià)預(yù)后模型的有效性；隨后繪制Kaplane-Meier曲線，并用Log-Rank檢驗(yàn)分析高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組間的差異。利用cytoscape的reactome fi插件構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)圖，探索與預(yù)后相關(guān)的可變剪接核心基因；利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 和 Gene Ontology(GO)對(duì)預(yù)后相關(guān)的可變剪接基因進(jìn)行功能注釋和信號(hào)通路分析。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體可變剪接事件

474名患者的13 684個(gè)基因中檢測(cè)到43 948個(gè)mRNA可變剪接事件，其中6 324個(gè)基因中檢測(cè)到16 793個(gè)ES事件，3 816個(gè)基因中檢測(cè)到8 992個(gè)AP事件，3 901個(gè)基因中檢測(cè)到8 546個(gè)AT事件，3 291個(gè)基因中檢測(cè)到3 559個(gè)AA事件，2 889個(gè)基因中檢測(cè)到3 057個(gè)AD事件，2 677個(gè)基因中檢測(cè)到2 781個(gè)RI事件，216個(gè)基因中檢測(cè)到220個(gè)ME事件。見(jiàn)圖1。

2.2 預(yù)后相關(guān)的可變剪接事件

通過(guò)單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，共有1 908個(gè)預(yù)后相關(guān)的可變剪接事件，其中包括430個(gè)ES事件， 704個(gè)AP事件，432個(gè)AT事件，104個(gè)AA事件，126個(gè)AD事件，104個(gè)RI事件，8個(gè)ME事件；UpSet plot 圖表明一個(gè)基因可以有多達(dá)幾種與預(yù)后相關(guān)的可變剪接事件。見(jiàn)圖2。

2.3 肺腺癌患者的預(yù)后信號(hào)

通過(guò)預(yù)后相關(guān)的可變剪接事件構(gòu)建預(yù)后模型，結(jié)果表明可變剪接事件可作為預(yù)后因子能高效地預(yù)測(cè)肺腺癌患者的臨床結(jié)果，見(jiàn)圖3；ROC曲線也證實(shí)了該預(yù)后模型具有較高的可靠性，AUC值為0.748，見(jiàn)圖4；每位患者基于可變剪接事件得到的風(fēng)險(xiǎn)值顯示，患者風(fēng)險(xiǎn)值越高，存活率越低，存活期越短，同時(shí)可見(jiàn)用于構(gòu)建預(yù)后模型的可變剪接事件在每位患者中的PSI值，見(jiàn)圖5。

圖1 肺腺癌中總體可變剪接事件的UpSet結(jié)果Fig.1 UpSet plots in lung adenocarcinoma showing the interactions among the seven types of alternative splicing events

圖2 肺腺癌中預(yù)后相關(guān)的可變剪接事件的UpSet結(jié)果Fig.2 UpSet plots of prognosis-related alternative splicing events in lung adenocarcinoma

圖3 可變剪接預(yù)測(cè)肺腺癌預(yù)后的Kaplan-Meier 曲線Fig.3 Kaplan-Meier curves of prognostic predictorsfor patients with lung adenocarcinoma

圖4 肺腺癌預(yù)后模型的ROC曲線Fig.4 ROC curves of prognostic predictors for patients with lung adenocarcinoma

注：A為476名患者通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)值分組，分為低風(fēng)險(xiǎn)(綠色點(diǎn))和高風(fēng)險(xiǎn)組(紅色點(diǎn))；B為肺腺癌患者的生存時(shí)間，左側(cè)和右側(cè)分別顯示低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)患者，綠點(diǎn)表示存活患者，紅點(diǎn)表示死亡患者；C為用于構(gòu)建預(yù)后模型的可變剪接事件的PSI值。圖5 預(yù)后模型對(duì)肺腺癌患者預(yù)后的識(shí)別Fig.5 The recognition capability of prognostic signature for dividing patients with lung adenocarcinoma into low-and high-risk groups

2.4 預(yù)后相關(guān)可變剪接事件的分子特征

基因功能注釋表明“cell-cell adhesion”、“macroautophagy”和“regulation of transcription from RNA polymerase II promoter”是3個(gè)最有效的“biological process”，“nucleoplasm”、“cytosol”和“cytoplasm”是3個(gè)最有效的“cellular component”，“protein binding”、“cadherin binding involved in cell-cell adhesion”和“kinase activity”是3個(gè)最重要的“molecular function”，見(jiàn)表1、2、3；KEGG途徑分析表明，主要富集的基因與“ “regulation of autophagy” , “central carbon metabolism in cancer” 和“cell cycle”有關(guān)，見(jiàn)表4；基因網(wǎng)絡(luò)互作圖結(jié)果表明CHEK1、KIF23、MCM7和FN1基因位于互作圖的核心位點(diǎn)，見(jiàn)圖6。

表1 預(yù)后相關(guān)可變剪接基因功能注釋(生物學(xué)過(guò)程)Tab.1 Gene ontology analysis of genes with survival-associated alternative splicing events: biological process

表2 預(yù)后相關(guān)可變剪接基因功能注釋(細(xì)胞成分)Tab.2 Gene ontology analysis of genes with survival-associated alternative splicing events: cellular component

表3 預(yù)后相關(guān)可變剪接基因功能注釋(分子功能)Tab.3 Gene ontology analysis of genes with survival-associated alternative splicing events: molecular function

表4 預(yù)后相關(guān)可變剪接基因KEGG信號(hào)通路分析Tab.4 KEGG pathway analysis of genes with survival-associated alternative splicing events

圖6 預(yù)后相關(guān)基因的網(wǎng)絡(luò)互作Fig.6 Prognosis-associated gene networks

2.5 肺腺癌組織驗(yàn)證

5例肺腺癌患者的癌組織PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，可變剪接核心基因CHEK1、KIF23、FN1確實(shí)存在CHEK1-AP-19309、KIF23-AP-31390、FN1-ES-57398等剪接體。

3 討論

前體mRNA的可變剪接作為基因修飾的轉(zhuǎn)錄后過(guò)程產(chǎn)生了大量的mRNA，形成蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的多樣性。特定的剪接亞型是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因子，其與腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、生存和耐藥性有關(guān)[1-3]。然而，由于肺腺癌細(xì)胞分子功能的復(fù)雜性和多樣性以及缺乏可獲得的大樣本公共選擇性剪接圖譜和對(duì)選擇性剪接的系統(tǒng)分析，選擇性剪接事件在肺腺癌中的作用仍有許多未解之謎。

本文采用多種生物信息學(xué)計(jì)算方法，結(jié)合可變剪接事件和肺腺癌患者的臨床結(jié)果，對(duì)選擇性剪接事件進(jìn)行綜合分析。根據(jù)預(yù)后相關(guān)的剪接事件和存活時(shí)間，將肺腺癌患者分為好和壞的預(yù)后的兩個(gè)亞組，本研究篩選了與預(yù)后相關(guān)的選擇性剪接的核心基因CHEK1、KIF23、MCM7及FN1，也分析了預(yù)后相關(guān)可變剪接基因的信號(hào)通路，如“regulation of autophagy”,“central carbon metabolism in cancer”和“cell cycle”；通過(guò)單因素回歸分析在474例肺腺癌患者得到1 908個(gè)預(yù)后相關(guān)的可變剪接事件，整合7種可變剪接事件的最終模型呈現(xiàn)較高的可靠效率值(AUC值為0.748)，并且能顯著區(qū)分好的或壞的臨床結(jié)果，表明可變剪接可作為預(yù)測(cè)肺腺癌患者臨床預(yù)后的指標(biāo)。預(yù)后相關(guān)基因的基因網(wǎng)絡(luò)互作圖表明CHEK1、KIF23、MCM7及FN1微管靶向藥物對(duì)非小細(xì)胞肺癌的療效[12]，KIF23是治療肺癌的潛在分子靶點(diǎn)[13]，MCM7可作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后標(biāo)志物[14]，F(xiàn)N1與肺癌的免疫治療效果相關(guān)[15]，因而這些核心基因的可變剪接可能在肺腺癌患者的預(yù)后起著重要的作用；進(jìn)一步KEGG對(duì)預(yù)后相關(guān)的可變剪接基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，呈現(xiàn)3個(gè)重要的信號(hào)通路，如：“regulation of autophagy”,“central carbon metabolism in cancer”和“cell cycle”。先前的研究也報(bào)道了這些信號(hào)通路與非小細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)，如lncrna-blacat1通過(guò)調(diào)節(jié)自噬參與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的耐藥性[16-20]，Microrna-21通過(guò)ampk/ulk1信號(hào)通路調(diào)節(jié)自噬活性從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[21-24]，F(xiàn)ASN通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝和AKT/ERK通路抑制非小細(xì)胞肺癌的惡化[25-27]，NME4調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和擴(kuò)散[28-30]。這些信號(hào)通路也可能與肺腺癌患者的預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，本研究系統(tǒng)描述了肺腺癌中的可變剪接事件，結(jié)果顯示可變剪接與肺腺癌患者臨床預(yù)后顯著相關(guān)，而且可變剪接可作為肺腺癌患者的臨床預(yù)后指標(biāo)，對(duì)為肺腺癌患者提供個(gè)體化治療具有重要的臨床意義。