鮑玲娜, 馬洪*, 李超, 孫俊澤

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔頜面外科， 貴州 貴陽 550004； 2.四川省腫瘤醫(yī)院·研究所 四川省癌癥防治中心 頭頸外科， 四川 成都 610000)

舌癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是口腔癌中最常見的種類，預(yù)后較差，患者5年生存率較低[1]。根據(jù)Globocan及世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年在我國口腔癌新發(fā)病例達(dá)到28 730例，死亡病例13 805例[2]，在科學(xué)技術(shù)日益發(fā)展的今天，仍無法有效干預(yù)TSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率及病死率未得到明顯改善。S100A8/A9蛋白又稱鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin)，是由S100蛋白家族中的重要成員，S100A8和S100A9蛋白以Ca2+依賴形式形成異二聚體復(fù)合物，在中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞中大量表達(dá)，參與腫瘤的免疫反應(yīng)[3-4]。研究顯示，較高濃度的S100A8/A9蛋白可以促使腫瘤細(xì)胞凋亡，而在低濃度時(shí)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移[5-7]?；|(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs) 是一類蛋白質(zhì)水解酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。MMP-2和MMP-9能夠降解基底膜最重要的成分Ⅳ型膠原，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中最直接、最重要的金屬蛋白酶[9-10]。本實(shí)驗(yàn)通過研究5 mg/L外源性S100A8/A9蛋白對舌鱗癌細(xì)胞SCC-25及CAL-27的侵襲能力和對MMP-2及MMP-9表達(dá)的影響，為S100A8/A9蛋白在舌鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人舌鱗癌細(xì)胞SCC-25及CAL-27購自美國模式菌種收集中心(ATCC，美國)，DMEM/F-12培養(yǎng)基、胰蛋白酶及青鏈霉素混合液購自美國Gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、離心管、Transwell小室及Matrigel matrix購自美國BD公司，胎牛血清(BI，以色列)，4%多聚甲醛溶液(Leagene，中國)，0.1% 結(jié)晶紫染色液(Solaibio，中國)，TriPure RNA Isolation Reagent(Roche，美國)，PrimeScriptTMRT reagent Kit (TAKARA，日本)。生物安全柜(ESCO，美國)，倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，美國)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 SCC-25及CAL-27細(xì)胞按ATCC官方說明分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1% 青鏈霉素的DMEM/F-12及DMEM完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～90% 時(shí)進(jìn)行傳代。將SCC-25及CAL-27細(xì)胞分別分為實(shí)驗(yàn)組及對照組，實(shí)驗(yàn)組用5 mg/ L S100A8/A9蛋白進(jìn)行干預(yù)24 h，對照組添加等量培養(yǎng)基。

1.2.2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將S100A8和S100A9重組蛋白以1 ∶1的質(zhì)量比均勻混合，置于4 ℃冰箱作用1 h，使之結(jié)合形成S100A8/A9復(fù)合物[7]。取對數(shù)生長期的SCC-25及CAL-27細(xì)胞進(jìn)行清洗、消化、重懸，并調(diào)整細(xì)胞濃度約1×105個(gè)/ mL。用對應(yīng)培養(yǎng)基以1 ∶5稀釋Matrigel matrix并鋪在Transwell小室底部，取0.2 mL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室，在下室內(nèi)添加0.5 mL完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)基中加入5 mg/ L S100A8/A9蛋白；4 h后取出小室，于4%多聚甲醛固定30 min，0.1% 結(jié)晶紫染色15 min，清洗、風(fēng)干，鏡下放大400倍觀察結(jié)晶紫染色情況并隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的穿聚碳酸酯膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR) 分別用Tripure法提取各細(xì)胞樣本的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA制備。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)及合成，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，行MMP-2及MMP-9基因?qū)崟r(shí)定量PCR擴(kuò)增。MMP-2引物F鏈為 CTGATGTCCAGCGAGTGGAT、R鏈為CTTCACCTCATTGTATCTCCAGAA，MMP-9引物F鏈為 CAGTACCGAGAGAAAGCCTATT、R鏈為 CAGGATGTCATAGGTCACGTAG，GAPDH引物F鏈為GTATCGTGGAAGGACTCATGAC、R鏈為ACCACCTTCTTGATGTCATCAT。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt相對定量法計(jì)算各組MMP-2及MMP-9基因的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞侵襲能力

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組降解人工基底膜并穿過聚碳酸酯膜的SCC-25及CAL-27細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P<0.05)，說明5 mg/L S100A8/A9蛋白能提高SCC-25及CAL-27細(xì)胞的遷移及侵襲能力。見圖1。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖1 S100A8/A9蛋白對SCC-25及CAL-27細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×40)Fig.1 Effect of S100A8/A9 protein on invasion ability of SCC-25 and CAL-27 cells

2.2 MMP-2及MMP-9基因表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組SCC-25及CAL-27細(xì)胞中MMP-2及MMP-9 基因表達(dá)水平均有不同程度升高，實(shí)驗(yàn)組SCC-25細(xì)胞中MMP-2及MMP-9 基因表達(dá)量分別是對照組的3.20及2.35倍，實(shí)驗(yàn)組CAL-27細(xì)胞中MMP-2及MMP-9 基因表達(dá)量分別是對照組的2.88及1.68倍，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖2 S100A8/A9蛋白對SCC-25及CAL-27細(xì)胞中MMP-2及MMP-9基因表達(dá)的影響Fig.2 Influence of S100A8/A9 on the reIative expression amount of MMP-2 and MMP-9 genes of SCC-25 and CAL-27 cells

3 討論

TSCC的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段、多機(jī)制共同調(diào)控而成，主要危險(xiǎn)因素包括大量持續(xù)咀嚼檳榔、吸煙、飲酒、HPV感染、銳利牙尖長期機(jī)械刺激、黏膜白斑、紅斑及其他理化因素等，這些因素引起基因突變，通過復(fù)雜機(jī)制造成。S100A8蛋白和S100A9蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在中性粒細(xì)胞(占所有胞漿蛋白的45%)、單核細(xì)胞等髓系細(xì)胞中大量表達(dá)，又稱為髓系相關(guān)蛋白(myeloid related protein, MRP)8型及14型[4，11]。腫瘤細(xì)胞激活后，S100A8/A9復(fù)合體以兩種不同的移位途徑分泌，其一根據(jù)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平，使得S100A8/A9蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞骨架和質(zhì)膜；其二依賴于蛋白激酶C的激活，S100A8/A9 蛋白被特異性的分泌到細(xì)胞外環(huán)境而發(fā)揮生物學(xué)作用[12]。S100A8/A9蛋白作為MRP可與髓系抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)相互作用，一方面MDSCs合成、分泌S100A8/A9蛋白；另一方面，S100A8/A9 蛋白可與MDSCs 表面的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(peceptor of advanced glycation end products，RAGE)上的羧酸化N聚糖結(jié)合，通過轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(nuclear factor-κ B，NF-κB)信號途徑，促進(jìn)MDSCs 的聚集[13]。這一過程可形成反饋環(huán)，促進(jìn)MDSCs向腫瘤部位遷移，抑制宿主介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4，14]。

腫瘤細(xì)胞通過其表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)中的某些成分結(jié)合后而激活或分泌蛋白降解酶類(主要為MMPs)來降解ECM，侵襲細(xì)胞基底膜(basement membrane，BM)，使腫瘤細(xì)胞的包膜破壞形成轉(zhuǎn)移通道而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。另外，MMPs也可直接作用于腫瘤細(xì)胞，釋放促進(jìn)生長或抑制凋亡的細(xì)胞因子。MMPs在結(jié)構(gòu)、分子功能和參與腫瘤進(jìn)展方面的特性為更有效地靶向腫瘤治療提供了新的途徑[16]。在口腔鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MMP-2的過表達(dá)是腫瘤侵襲的必要條件，并且與口腔鱗癌局部復(fù)發(fā)之間存在顯著的相關(guān)性，MMP-2下調(diào)可減少腫瘤血管生成[17]，說明MMP-2和MMP-9的表達(dá)在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過對Transwell小室底部鋪一層基質(zhì)膠來人工模擬腫瘤細(xì)胞降解基底膜而發(fā)生侵襲的過程，該基質(zhì)膠是從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠肉瘤中分離得到，其主要成分是層黏連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、生長因子及基質(zhì)金屬蛋白等。在室溫下，它可以聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)進(jìn)而模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成以及物理化學(xué)特性等。通過甲醛固定及結(jié)晶紫染色檢測到在5 mg/L外源性S100A8/A9蛋白作用下，SCC-25及CAL-27細(xì)胞降解基質(zhì)膠發(fā)生侵襲的作用明顯增強(qiáng)，穿過小室底部的聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)明顯增多。實(shí)驗(yàn)也通過RT-qPCR檢測到經(jīng)過5 mg/L外源性S100A8/A9蛋白處理后，SCC-25及CAL-27細(xì)胞中與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)蛋白酶MMP-2和MMP-9基因表達(dá)量明顯增多，說明5 mg/L外源性S100A8/A9蛋白可以增強(qiáng)SCC-25及CAL-27細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，提示S100A8/A9蛋白可能在TSCC局部侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用，從而與TSCC的不良預(yù)后密切相關(guān)。

隨著腫瘤分子生物學(xué)的不斷深入研究，對于TSCC的研究范圍也得以延伸，如TSCC發(fā)生前因素口腔黏膜白斑和紅斑、HPV感染、DNA甲基化等，TSCC發(fā)生中通路Wnt/β-Catenin、p38 MAPKs、SAP/JNK磷酸化、NF-κB、EMT等研究逐漸成為熱點(diǎn)；有針對細(xì)胞周期、活性氧簇、細(xì)胞凋亡家族(Bcl-2家族、caspase家族)等的相關(guān)研究，研究技術(shù)也不斷更新，有體內(nèi)可視化、熒光內(nèi)鏡、唾液和血清檢測及siRNA技術(shù)等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展，科研的深度及廣度可大大提高，探究敏感的腫瘤標(biāo)志物有利于改善TSCC患者的生存率以及減少其復(fù)發(fā)率。

綜上所述，5 mg/L外源性S100A8/A9蛋白能增強(qiáng)TSCC細(xì)胞的侵襲能力、增加MMP-2和MMP-9基因表達(dá)，S100A8/A9蛋白可能在TSCC侵襲進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可作為潛在的TSCC標(biāo)志物進(jìn)行深入研究。