張軍波, 呂穎, 劉仲偉, 潘軍強， 殷艷蓉

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院 周圍血管科， 陜西 西安 710061； 2.西安交通大學第三附屬醫(yī)院&陜西省人民醫(yī)院 心內科， 陜西 西安 710068； 3.西安交通大學第一附屬醫(yī)院 心血管內科， 陜西 西安 710061)

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的心律失常之一，約20%的中國成年人罹患AF，并隨年齡增長而增加[1]。血栓栓塞是AF患者最常見的并發(fā)癥，也是AF患者致死、致殘的重要原因[2]。心臟纖維化是AF最重要也最顯著的病理改變，主要表現(xiàn)為心臟膠原蛋白沉積、心肌排列紊亂及心臟膠原比例的改變[3]。纖維化能破壞細胞間縫隙連接，心房肌被分割包繞，使得生理電信號不能順利傳導，形成多個折返環(huán)路，從而引發(fā)和維持AF[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，干預纖維化可有助于預防AF的復發(fā)[4]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARα)是核受體超家族的成員，是脂肪酸平衡的主要調節(jié)因子，主要在肝臟、腎臟及心臟等高代謝器官中表達[5]，具有保護心臟的作用[6]，參與了心臟纖維化過程[7]。既往的研究多基于動物心臟標本，對人群的研究較少，本文采用HE及Masson染色觀察AF患者心房組織纖維化情況，采用實時熒光定量PCR(Realtime-PCR)法測定心房組織中PPARαmRNA表達，分析AF患者心肌中PPARα的表達與心肌纖維化的關系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料及試劑

1.1.1一般資料 選取2012年5-8月在心臟外科行人工心臟瓣膜置換術的風濕性心臟瓣膜病患者81例，排除合并肝功能衰竭、腎功能衰竭、甲狀腺功能亢進癥、高血壓及各種類型的心肌病患者，排除合并結締組織病、風濕熱活動期及腫瘤患者。81例患者按心電圖表現(xiàn)分為AF組(n=38)及竇性心律組(n=43，持續(xù)竇性心律無AF病史患者)。

1.1.2主要試劑 正反向引物及測序引物由上海尼桑生物公司合成，反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自Takara公司，其余均為國產分析純。PTC-200DNA擴增儀為美國MJ公司產品，XSP-2CA生物顯微鏡和IMP-2型倒置相差生物顯微鏡均來自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1右心房組織學觀察 采用HE及Masson染色法，選取手術中廢棄的右心房右心耳組織，清洗后液氮保存；分為3份，一份用于檢測PPARα mRNA表達，2份用于組織學觀察。(1)HE染色，取右心耳組織，經固定、脫水、OCT包埋速凍后進行冰凍切片及HE染色封片，鏡下觀察染色情況；(2)Masson染色，取右心耳組織，切片晾置甲醇固定后，分別經蘇木素染色、鹽酸酒精分化、品紅復染、沖洗后苯胺藍復染、冰醋酸固定、酒精脫水、二甲苯透明后封片，鏡下觀察染色情況。

1.2.2PPARαmRNA表達 采用Realtime-PCR，所有用品經預防RNA酶污染處理后，取右心耳組織提取總RNA，逆轉錄為cDNA。應用Primer primier 5.0軟件，設計引物序列，內參hGAPDH上游引物序列為5′-TCATGGGTGTGA ACCATG AGA A-3′、下游引物序列為5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG T-3′，PPARα上游引物序列為5′-CGAATGTAGAATCTGCGGGG-3′、下游引物序列為5′-CATCCCGACAGAAAGGCACT-3′。PCR反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，56 ℃延伸30 s，擴增 40個循環(huán)后收集數(shù)據(jù)，繪制動力學曲線讀取 Ct值。將各組目的基因的Ct值與管家基因hGAPDH的Ct 值相減得△Ct，擴增重復 3 次，計算出各組PPARαmRNA 的表達，進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 右心房組織學觀察

染色結果顯示，AF組患者心房組織纖維化較竇性心律組加重，HE染色可見(圖1A-B)，竇性心律組心房組織排列有序，心肌細胞間有少量纖維組織，而AF組的心房組織結構明顯紊亂，心肌細胞肥大，排列不勻，可見組織間空隙較多，細胞核濃染，大小不一，細胞間隙可見明顯纖維組織增生。Masson染色可見(圖1C-D)膠原纖維呈藍色，心肌細胞胞質、肌纖維和紅細胞呈紅色，而心肌細胞核呈藍褐色；竇性心律組患者心房肌細胞排列均勻，肌細胞間隙可見少量藍色膠原纖維組織，而AF組患者心房肌細胞肥大，排列較稀疏，可見藍色膠原纖維組織分割包繞褐色的心房肌細胞，細胞間間隙增大，其中藍色膠原纖維組織較竇性心律患者明顯增多。

注：A、B為HE染色，C、D為Masson染色；A、C為竇性心律組，B、D為AF組。圖1 兩組患者右心房組織(HE、Masson染色，×200)Fig.1 Right atrial tissue of both group patients

2.2 PPARα mRNA相對表達水平

2.2.1擴增曲線和溶解曲線PPARαmRNA擴增曲線拐點明確，整體擴增曲線平行性較好，基線較水平，無明顯上揚，各管的擴增曲線平行性好，表明各反應管的擴增效率相近；溶解曲線僅出現(xiàn)一個有效峰值，提示產物特異性良好。見圖2。

圖2 PPARα mRNA擴增曲線及溶解曲線Fig.2PPARα mRNA amplification curve and melt curve

2.2.2PPARαmRNA相對表達水平 如圖3所示，AF組2-ΔΔCT=0.36±0.07，竇性心律組2-ΔΔCT=1.00±0.16， AF組PPARαmRNA相對表達水平明顯低于竇性心律組，差別具有統(tǒng)計學意義(t=-3.61，P=0.003)。提示AF患者右心房組織PPARαmRNA的相對表達水平較竇性心律患者低。

注： (1)與AF組比較，P<0.01。圖3 兩組患者PPARα mRNA相對表達水平Fig.3 Relative expression level of PPARα mRNA of both groups

3 討論

引起AF的原因眾多，老年退行性改變、長期高血壓、甲狀腺功能亢進等都可以引起AF[8]。目前將外科換瓣術后或風濕性心臟瓣膜病，尤其是二尖瓣狹窄相關的AF稱作瓣膜性AF[9]。AF患者的卒中的風險是無AF患者的6倍，當二尖瓣狹窄合并AF時，這個風險增加到15倍[10]。

本研究結果證實瓣膜性AF患者右心房纖維化程度較正常對照組明顯加重，無論HE染色還是針對纖維組織的Masson染色均發(fā)現(xiàn)，竇性心律組患者的右心房組織內心房肌細胞排列均勻，細胞間隙少量藍色膠原纖維組織，而瓣膜性AF患者心房肌細胞肥大，排列紊亂，被大量膠原纖維組織分割包繞。已有研究證實，AF與心肌纖維化常常伴隨發(fā)生，在孤立性AF患者心房活檢標本中也證實，75%的患者存在明顯的心肌纖維化[11]。另一項長期快速起搏導致AF的模型研究證實，心肌纖維化程度和AF密切相關[12]。對于人群孤立性AF的研究，也證實初始心房正常大小的患者在隨訪20個月里心房發(fā)生了明顯的擴大[13]。在犬AF模型的研究發(fā)現(xiàn)AF可以誘發(fā)并促進心房擴大進程，同時導致心肌纖維化進行性加重[14]。以上研究結果提示，心肌纖維化的病理過程啟動后，隨著纖維化的加重，可以繼續(xù)促進AF，這形成了一個惡性循環(huán)[15]。

PPARα能改善血脂對心肌的作用，主要機制為PPARα刺激脂蛋白脂酶表達，促進脂蛋白釋放脂肪酸顆粒和隨后的吸收[16]。氧化應激誘導一些促炎性細胞因子的產生，這可能促進與許多疾病狀態(tài)相關的病理老化，給老年小鼠服用能夠激活PPARα的藥物后，可以恢復細胞的氧化還原平衡，降低組織脂質過氧化作用，持續(xù)消除激活的核轉錄因子kappa B(nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)并抑制炎性因子如血管內皮細胞黏附分子-1、血小板內皮細胞黏附分子和細胞間黏附分子-1的產生[17]。研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸甲酯可以激活小鼠PPARα的表達，促進β-氧化蛋白和基因表達，進而改善非酒精性脂肪肝[18]。對大鼠肝纖維化的研究發(fā)現(xiàn)，PPARα和PPARγ雙激動劑可以通過抑制瘦素、轉化生長因子β1和血小板衍生生長因子BB，從而降低金屬蛋白酶組織抑制劑-1的表達，從而發(fā)揮抗纖維化的作用[19]。對心臟研究發(fā)現(xiàn)，PPARα激動劑非諾貝特可以預防血管緊張素灌流大鼠的心肌炎癥，在減少炎癥因子的表達同時，可以減少轉化生長因子-β1的表達、減少膠原沉積并改善纖維化[20]；還可以抑制腹主動脈結扎導致壓力超負荷大鼠心肌膠原和內皮素-1的表達，改善心肌纖維化[21]。PPARα激活后可以通過抑制內皮素-1改善單腎切除高血壓大鼠左心室的心肌纖維化，但對于左心室心肌肥厚作用不大[22]。對于缺血性心肌病導致的心力衰竭患者行心臟移植術中取得的人體標本研究發(fā)現(xiàn)，心衰的心室中纖維化加重，而相對與正常的心臟，衰竭心臟的PPARα和PPARγ選擇性的激活，在維持心房形態(tài)方面起了重要的作用[23]。

綜上所述，在瓣膜性AF患者的心房組織中，纖維化明顯加重，而PPARα的表達較竇性心律人群下降，提示瓣膜性AF患者的心房組織纖維化明顯加重，可能與心房組織的PPARα下降有關。但還需要進一步的研究證實。