潘潔， 秦蘭,2， 楊淑婷,2， 鞏仔鵬， 李勇軍， 陸苑**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心&省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)主要存在肝臟中，是介導(dǎo)藥物體內(nèi)代謝最重要的一種超基因家族酶[1-2]。CYP450酶最主要的6種酶為CYP1A2、CYP2C11(人CYP2C9)、CYP2C19、CYP2D4(人CYP2D6)、CYP2E1及CYP3A2(人CYP3A4)，介導(dǎo)著體內(nèi)絕大多數(shù)藥物的代謝[3-4]。臨床藥物代謝相互作用導(dǎo)致的不良反應(yīng)中，70%是由于CYP450酶被抑制[5-6]，因此，研究體外藥物對CYP450酶主要亞型酶的抑制作用顯得極其重要[7-8]。羊耳菊(Inulacappa，YEJ)為菊科旋覆花屬植物的新鮮或干燥全草[9]，是貴州苗族常用藥材，苗語藥名為“Bex nioux dant”(近似漢譯音為“白牛膽”)，在《苗族醫(yī)藥學(xué)》《中華本草·苗藥卷》、2003 版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標準》中均有收載，常用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、風濕疼痛、癰瘡疔毒及乳癰等癥，有獨特療效[10-11]。目前，市場上產(chǎn)品連菊感冒膠囊、鼻康片、雙喉痹通顆粒和菊上黃清片等制劑均以YEJ為主藥[12-13]，這些制劑或YEJ草藥存在與其他抗菌藥聯(lián)合用藥的情況[14]。通常情況下抗菌藥物的治療效果由其血藥濃度決定，若血藥濃度過低，達不到治療效果，反而導(dǎo)致耐藥性的發(fā)生。目前，有關(guān)于YEJ對CYP450酶的體外抑制作用尚未見報道，本研究采用肝微粒體體外孵育技術(shù)結(jié)合“Cocktail探針藥物法”，以非那西丁、氯唑沙宗、右美沙芬、奧美拉唑、甲苯磺丁脲、咪達唑侖和睪酮為探針藥物，考察YEJ提取物對大鼠和人肝微粒體CYP450的6種主要亞型酶CYP1A2、CYP2C11(人CYP2C9)、CYP2C19、CYP2D4(人CYP2D6)、CYP2E1、CYP3A2(人CYP3A4)的抑制作用，預(yù)測其在聯(lián)合用藥時潛在的代謝性相互作用，為其臨床聯(lián)合用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器 超高液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters 公司)，CS501A超級恒溫水浴箱(中國重慶銀河試驗儀器有限公司)，Allegra 64R低溫高速離心機(美國Beckman Coulter公司)，700系列超低溫冰箱(美國Thermo公司)。

1.1.2藥材與試劑 實驗中所用YEJ藥材采集于貴州，經(jīng)過貴州省食品藥品檢驗所李楊主任藥師鑒定為Inulacappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.全草，非那西丁、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、右美沙芬、睪酮購于美國Sigma公司(批號分別為81105、90925、20321、10519、090M1298V)，咪達唑侖注射液購于江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司(批號0150120)，氯唑沙宗、對乙酰氨基酚購于中國食品藥品檢定研究院(批號分別為100364-200301、100018-200408)，右啡烷購于上海樊克生物有限公司(批號FK-J1795)，6-羥基氯唑沙宗、羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑和6β-羥基睪酮購于加拿大TRC公司(批號分別為1-PSB-27-2、1-PSB-27-2、6-QFY-28-2、KIT0635)，α-羥基咪達唑侖購于美國Cerilliant公司(批號FN101512-07)，混合人肝微粒體(HLM)購于美國BD公司，G-6-P、G-6-PD購于美國Sigma公司，NADP+購于Roche公司，乙腈購于德國默克試劑公司，其他無機鹽均為分析純，甲醇為色譜純。

1.1.3實驗動物 健康SD大鼠、雄性、體質(zhì)量(280±20)g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，為清潔級動物，動物許可證號[SCXK(渝)2015-0001]。

1.2 方法

1.2.1液相條件 色譜柱Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)柱，流速為0.35 mL/min、柱溫45 ℃、流動相為0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。檢測7種專一性代謝產(chǎn)物的梯度條件為0～3.0 min 5%～65% A，3.0～3.5 min 65%～90% A，3.5～4.5 min 10% A。進樣體積為2 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)，毛細管電壓 3 kV，離子源溫度 120 ℃，去溶劑氣溫度 350 ℃，去溶劑氣 N2、流速 650 L/h，反吹氣 N2、流速 50 L/h，碰撞氣 Ar、流速 0.16 mL/min，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站，掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)，離子對條件見表1。

表1 質(zhì)譜條件Tab.1 The mass spectrometric settings

1.2.3制備大鼠混合肝微粒體(RLM) 6只雄性SD大鼠，禁食過夜，自由飲水；次日，股動脈處死，立即取出肝臟、采用鈣鹽沉淀法[15]制備肝微粒體，混合均勻并分裝，于-80 ℃下儲存?zhèn)溆?；臨用前按考馬斯亮藍試劑盒指導(dǎo)方法測定總蛋白濃度，再用PBS(0.1 mol/L, pH 7.4)緩沖鹽溶液配制成所需濃度。

1.2.4YEJ提取物對RLM和HLM中CYP450亞型酶的抑制作用 孵育體系終體積為200 μL，包括肝微粒體蛋白(0.5 g/L)、NADP+(20 g/L)、G-6-P(20 g/L)、MgCl2(13.3 g/L)、G-6-PD(40 U/mL)，非那西丁(1.0 mol/L)、氯唑沙宗(1.5 mol/L)、右美沙芬(1.0 mol/L)、奧美拉唑(0.25 mol/L)、甲苯磺丁脲(1.0 mol/L)、咪達唑侖(0.5 mol/L)和睪酮(0.5 mol/L)，以及不同濃度(0.01、0.05、0.25、0.5、1 g/L)的YEJ提取物，冰浴上操作。在RLM或HLM孵育體系中加入不同濃度YEJ提取物后，37 ℃恒溫水浴中預(yù)孵3 min，再加入混合探針底物開始反應(yīng)；實驗中溶解探針藥物的有機溶劑甲醇小于1%，DMSO小于0.1%，不引起酶活性的改變；孵育時間為60 min，每個濃度平行操作5次，反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL冰甲醇終止反應(yīng)，再加入100 μL內(nèi)標溶液(葛根素2 mg/L)、渦混、超聲3 min、15 000 r/min離心10 min，取上清液2 μL按照“1.2.1”和“1.2.2”項下UPLC-MS/MS分析7種探針藥物對應(yīng)的代謝物生成量，通過GraphPad v 5.0軟件擬合曲線并計算半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

2 結(jié)果

以空白溶劑組的代謝物生成量為V0，其余不同體積百分濃度的代謝物生成量為Vx，剩余酶活性I=(1-Vx/V0)×100；然后以剩余酶活性為縱坐標，YEJ提取物提取物不同濃度的對數(shù)值為橫坐標，通過GraphPad v 5.0軟件擬合曲線并計算IC50值。結(jié)果如表2和圖1所示，CYP1A2、CYP2C11(人CYP2C9)、CYP2C19、CYP2D4(人CYP2 D6)、CYP2E1和CYP3A2(人CYP3A4)亞型酶的IC50值遠遠大于羊耳菊提取物臨床一次劑量(0.011 32～0.022 65 g/L)，提示羊耳菊提取物對CYP1A2、CYP2C11(人CYP2C9)、CYP2C19、CYP2D4(人CYP2 D6)、CYP2E1和CYP3A2(人CYP3A4)亞型酶活性體外抑制作用較弱。

表2 YEJ提取物對RLM和HLM 6種CYP450亞型酶的IC50Tab.2 IC50 values of YEJ extract on six CYP450 isoforms in RLM and HLM

注：a示對乙酰氨基酚生成量，表示CYP1A2酶剩余活性；b示右啡烷生成量，表示CYP2D6酶剩余活性；c示6-羥基氯唑沙宗生成量，表示CYP2E1酶剩余活性；d示羥基奧美拉唑生成量，表示CYP2C19酶剩余活性；e示羥基甲苯磺丁脲生成量，表示CYP2C9酶剩余活性；f示α-羥基咪達唑侖生成量，表示CYP3A4酶剩余活性；g示6β-羥基睪酮生成量，表示CYP3A4酶剩余活性。圖1 YEJ提取物對RLM和HLM 6種CYP450亞型酶的抑制作用(n=3)Fig.1 In vitro inhibitory effects of YEJ extract on the activities of six CYP450 isoforms in RLM and HLM

3 討論

藥物代謝酶以CYP450為主，藥物對CYP450酶活性的抑制作用將導(dǎo)致聯(lián)用藥物的毒副作用的發(fā)生，因此為保證患者用藥的安全性及有效性，在中藥的口服制劑研究過程中考察藥物對CYP450酶潛在的抑制作用是不可或缺的一部分[16-17]。大鼠和人存在種屬差異[18-19]，因此本實驗采用肝微粒體體外孵育技術(shù)結(jié)合“Cocktail探針藥物法”，考察了YEJ提取物對RLM和HLM中6種亞型CYP1A2、CYP2C11(人CYP2C9)、CYP2C19、CYP2D4(人CYP2 D6)、CYP2E1和CYP3A2(人CYP3A4)的酶活性的影響。結(jié)果表明，YEJ提取物對大鼠肝微粒體CYP1A2、CYP2C11、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1和CYP3A2的IC50值范圍為0.287～152.407 g/L，對人肝微粒體CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2 D6、CYP2E1和CYP3A4的IC50值范圍為0.258～19.275 g/L。YEJ 1次口服生藥量為15～30 g生藥/次[20]，其提取物的轉(zhuǎn)化率為7%，則生藥相當于1.05～2.1 g YEJ提取物，對應(yīng)孵育體系中藥物濃度分別為0.011 32～0.022 65 g/L，IC50遠高于臨床一次口服劑量，提示YEJ提取物對RLM和HLM中6種亞型酶活性的抑制作用非常弱，因此推測YEJ有關(guān)制劑在臨床上使用時，與其他藥物發(fā)生競爭性抑制作用的可能性比較低。