趙道全，武慧慧，陳軍平，李先明，謝國強，胡亞東，李治勛

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基于SCSA烏蘇里擬鲿精子保存液的使用效果＊

趙道全，武慧慧，陳軍平，李先明，謝國強，胡亞東，李治勛

（河南省水產科學研究院，河南 鄭州 450044）

魚類精子質量是影響人工繁殖的重要因素，雌雄性成熟不同步或需殺雄魚取精的魚類，為了保障其規(guī)?；敝?，采用精子保存液將精子暫存起來，繁殖時隨用隨取，因此，精子保存液的保存效果又直接影響著人工繁殖。如何確定保存液中精子的質量，可以用鏡檢宏觀判斷，但這樣并不精準。SCSA通過量化判斷出保存液中精子的質量，從而為繁殖提供保障。自行研制的hnscz擬鲿精子保存液經SCSA分析測試，其實際應用優(yōu)于購買的hanks精子保存液。測試結果為≤0.15，精子活力旺盛，使用效果明顯。

SCSA；精子保存液；DNA斷裂指數；精子活力

烏蘇里擬鲿（Pseudobagrus ussuriensis）隸屬于鲇形目鲿科魚類，生活于江河底層，以底棲動物為食，如蜉蝣類、毛翅幼蟲等，幼魚以搖蚊幼蟲為食。

該魚分布在我國各大水系，但總體資源量有限，屬稀有物種。3 齡達性成熟，產卵期在5月中旬至7月末，自然產卵量很少。

人工繁殖需殺雄魚取精，規(guī)?；敝承杼崆坝帽４嬉罕４?zhèn)溆茫瑥亩岣咝屎托Ч?/p>

精子染色質結構分析（SCSA）是檢測精子DNA完整性的一種方法，其原理是正常精子DNA呈雙鏈結構，而受損的精子染色質結構松散，DNA在酸的作用下變性成單鏈。利用吖啶橙（AO）與雙鏈DNA結合發(fā)綠色熒光，而與單鏈DNA結合發(fā)紅色熒光的特性，AO染色后的精子懸液利用流式細胞儀分析可判斷精子質量[1]。

1 材料和方法

試劑：吖啶橙（AO）染液、鹽酸、hanks精子保存液（商品購買）、hnscz精子保存液（自配優(yōu)選）。

樣本：取精子研磨[2]，分別取hnscz和hanks精子保存液各8 mL，顯微鏡觀察后稀釋精液，根據實驗設計時間段，提前按4 h、96 h、144 h稀釋好后分別用試管標號放置于4 ℃冰箱冷藏保存待用[3-5]。

分別取hnscz和hanks保存的4 h、96 h、144 h精子各30 μL；+ 酸吸液80 μL（反應30 s）；+ AO染色液100 μL（反應3 min）；上機（Cyto FLEX流式細胞儀）檢測。

實際人工授精驗證分別取不同保存時間的精子與人工催產后擠出的烏蘇里擬鲿卵授精[6]，把授精卵分別按標號放入孵化框，在孵化槽中孵化5 h統(tǒng)計受精率[7]。

2 結果與分析

2.1 斷裂指數分析

在FSC/SSC圖上圈出精子細胞，設門至FL1（FITC）/FL3（ECD）散點圖上進行分析。DNA完整性好的精子主要發(fā)綠色熒光（P2 門）；DNA完整性差的精子主要發(fā)紅色熒光（P4 門）。通過公式計算DNA斷裂指數來評價精子DNA質量，=red/（red + green）.

從實驗測試數據得出以下結果。

Hnscz：

1=6.37÷（39.03+6.37）=0.14.

2=11.28÷（40.65+11.28）=0.21.

3=9.48÷（23.23+9.48）=0.29.

Hanks：

1=9.44÷（32.10+9.44）=0.23.

2=8.29÷（17.18+8.29）=0.32.

3=18.85÷（38.54+18.85）=0.32.

從以上斷裂指數結果來看，我們配置的hnscz精子保存液保存的精子比購買的hanks精子保存液保存的精子的斷裂指數小，即hnscz1＜hanks1；hnscz2＜hanks2；hnscz3＜hanks3，這說明自己研制的精子保存液hnscz優(yōu)于商業(yè)購買的hanks精子保存液。

2.2 實驗驗證分析

兩種精子保存液實用效果對照如表1所示。

表1 兩種精子保存液實用效果對照

精子保存時間/h496144 hnscz受精率/（%）98.287.681.4 hanks受精率/（%）83.013.311.5

實際人工授精驗證結果：hnscz保存的精子144 h受精率81.4%，保持較高水平，與流式細胞儀測試的DNA斷裂指數hnscz3=0.29，與較低水平結果相吻合；hanks保存的精子144 h受精率11.5%，已達到很低的水平，不能作為實際人工繁殖使用，與流式細胞儀測試的DNA斷裂指數hanks3=0.32較高水平的結果一致。

2.3 鏡檢觀察

用顯微鏡觀察[8-9]，hnscz保存液保存的精子6 d精子活力還旺盛，7 d活力開始減弱，9 d死亡；hanks保存液保存的精子1 d、2 d活力較強，4 d活力減弱，5 d死亡。

3 結論

SCSA判定精子質量快速準確，并能量化分析，是人工保存精子使用前檢測精子活力強弱的重要手段。

烏蘇里擬鲿精子保存液hnscz經SCSA分析和實際應用檢驗，在4 ℃冰箱中可以人工保存一周時間并保持精子活力旺盛，是實現規(guī)?；敝车谋ＷC。

對于烏蘇里擬鲿人工保存的精子來說，根據參考文獻[1]和測試實驗結果分析認為，DNA斷裂指數≤0.15則精子活力旺盛，保存的精子可以作為人工授精的精子來源。DNA斷裂指數≥0.3則精子趨于衰竭，不再作為人工授精的精液來源。

［1］Apedaile AE，Garrett C，Liu DY，et al. Flow cytometry and microscopic acridine orange test：relationship with standard semen analysis［J］.Reprod Biomed Online，2004，8（04）：398-407.

［2］楊家云.瓦氏黃顙魚精巢發(fā)育及精子生物學研究［J］.西南師范大學學報（自然科學版），2005，30（04）：719-724.

［3］陳松林.魚類精子和胚胎冷凍保存理論和技術［M］.北京：中國農業(yè)出版社，2007.

［4］陳松林，劉憲亭，魯大春，等.鰱、鯉、團頭魴和草魚精液冷凍保存的研究［J］.動物學報，1992，38（04）：413-424.

［5］于海濤，張秀梅，陳超.魚類精液超低溫冷凍保存的研究展望［J］.海洋湖沼通報，2004（02）：66-72.

［6］王明華，蔡永祥，陳校輝，等.烏蘇里擬鲿人工繁育技術［J］.水產養(yǎng)殖，2010，31（04）：23-24.

［7］高征，崔杰，徐廣紅，等.烏蘇里擬鲿人工繁殖方法［M］.長春：吉林農業(yè)大學出版社，2010.

［8］羅相忠，鄒桂偉，潘光碧.大口鲇精子生理特性的研究［J］.淡水漁業(yè)，2002，32（02）：51-53.

［9］魯大春，傅朝君，劉憲亭，等.我國主要淡水養(yǎng)殖魚類精液的生物學特性［J］.淡水漁業(yè)，1989（02）：34-37.

趙道全（1964—），男，教授級高級工程師，從事魚類遺傳育種及工廠化養(yǎng)殖技術研究。

河南省重點科技攻關項目（編號：172102110097）

2095－6835（2019）02－0008－02

Q492

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.02.008

〔編輯：張思楠〕