曹 川，申明玉，許 莉，韋冬梅，周裔彬,*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230001；2.安徽糧食工程職業(yè)學(xué)院糧食工程系，安徽 合肥 230011）

淀粉作為能量儲存物質(zhì)，廣泛來源于種子、水果及植物根系中，不同植物來源淀粉的形態(tài)和結(jié)晶結(jié)構(gòu)各不相同，直鏈淀粉、支鏈淀粉組成有所差異，理化性質(zhì)以及對普魯蘭酶水解的靈敏性也不同[1-2]。普魯蘭酶是一種脫支酶，作為外切酶，能夠?qū)Ｒ恍缘厍懈钇咸烟铅?1,6-糖苷鍵，應(yīng)用于淀粉的脫支[3]。不同脫支程度淀粉產(chǎn)物的聚合度（degree of polymerization，DP）不同，淀粉完全脫支產(chǎn)生具有一定鏈長的線性糊精，DP范圍一般在6～100之間，Klaochanpong[4]和Precha-Atsawanan[5]等比較脫支蠟質(zhì)淀粉與天然蠟質(zhì)淀粉的膠凝性能發(fā)現(xiàn)，脫支淀粉（debranched starches，DBS）產(chǎn)生的凝膠較為混濁，具有光澤的外觀和較低的黏度，而天然淀粉產(chǎn)生的凝膠均勻、透明且黏度較高。Liu Guodong等[6]應(yīng)用普魯蘭酶對4 種不同來源DBS的水解特性和凝膠特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明：所有DBS均為V型淀粉，具有中空、單螺旋結(jié)構(gòu)；脫支處理對淀粉黏度影響較大，使淀粉黏度下降，DBS能夠捕獲水以形成水凝膠；脫支有效地改善了淀粉的溶解度和持水能力，有助于其凝膠的形成。DBS的特殊功能特性逐漸受到研究者的青睞，特別在回生特性、凝膠性能等方面[7-8]。

本實驗選擇糯米、粳米和秈米3 種大米淀粉，研究普魯蘭酶處理前后3 種大米淀粉脫支衍生物的晶體結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量分布、溶解度、黏度和流變學(xué)特性，為淀粉基包埋產(chǎn)物的緩慢釋放提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米、粳米和秈米由安徽省惠豐糧食儲備庫提供。

普魯蘭酶（EC 3.2.1.41） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、乙酸鈉、無水乙醇、乙酸（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RVA-4500快速黏度分析儀 瑞典波通儀器公司；TTR-III X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀日本理學(xué)電機公司；Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀、ICS5000高效陰離子交換色譜（high-performance anionexchange chromatography，HPAEC）儀、Dionex?CarboPac? PA200離子交換柱（250 mm×1 mm，5.5 μm） 美國Thermo Fisher Scientific公司；DHR系列流變儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 DBS的制備

通過稀堿浸泡分離法制得糯米、粳米和秈米3 種大米淀粉，3 種大米原淀粉中直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為糯米1.97%、秈米25.65%、粳米17.23%。

DBS制備：參考劉國棟[9]和Cai Liming[10]等的方法，并做適當(dāng)修改。將淀粉和乙酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 5.5）按料液比1∶20加入500 mL帶塞錐形瓶中，置于集熱式磁力攪拌器上于105 ℃下恒溫攪拌30 min，然后轉(zhuǎn)移到滅菌鍋中，121 ℃下加熱1 h徹底糊化，再將淀粉糊冷卻至50 ℃，加普魯蘭酶，50 ℃反應(yīng)12 h，將酶解液濃縮至200 mL后緩慢加入無水乙醇中，容量瓶定容至1 000 mL，放置室溫過夜，再以5 000 r/min離心15 min，收集沉淀物，沉淀用無水乙醇洗滌3 次，最后冷凍干燥、研磨和篩分，待用。

1.3.2 XRD分析

采用XRD儀測定天然淀粉和DBS冷凍干燥粉末的結(jié)晶度。儀器條件：管壓40 kV、管流80 mA、衍射角（2θ）掃描區(qū)域為0°～50°、掃描速率2°/min。參考Lopez-Rubio等[11]的方法使用PeakFit 4.12軟件對淀粉顆粒結(jié)晶峰面積和非晶區(qū)域進(jìn)行分析。平均鏈長（以DP表示）按式（1）計算。

1.3.3 HPAEC分析

參考Liu Guodong等[1]的方法，采用HPAEC儀（配備電化學(xué)檢測器）測定天然淀粉和DBS冷凍干燥粉末的鏈長分布。分析條件：進(jìn)樣量50 μL；柱溫25 ℃；流動相A為ddH2O；流動相B為100 mmol/L NaOH；流動相C為100 mmol/L NaOH/500 mmol/L NaAc；流速0.5 mL/min。

1.3.4 FT-IR分析

稱取一定質(zhì)量的天然淀粉和DBS冷凍干燥粉末，分別添加100 倍質(zhì)量的無水KBr研磨混合，將所得樣品粉末壓縮成薄圓盤狀。掃描范圍為4 000～400 cm－1，分辨率為4 cm－1。

1.3.5 黏度分析

采用快速黏度測定儀對天然淀粉和DBS的黏度進(jìn)行測定。測試程序參考美國谷物化學(xué)家協(xié)會的方法[12]進(jìn)行，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定為14%，稱取樣品冷凍干燥粉末3.00 g，加入蒸餾水25 mL。溫度設(shè)定程序：50 ℃保持1 min，以12 ℃/min上升到95 ℃，保持2.5 min，再以12 ℃/min下降到50 ℃，保持1.4 min。待天然淀粉完成黏度測定后取出糊化桶，將普魯蘭酶加入混合物中，重新設(shè)定程序使溫度在50 ℃保持60 min，測定DBS黏度。

1.3.6 流變學(xué)性質(zhì)分析

淀粉糊糊化完全后冷卻至50 ℃，添加普魯蘭酶，繼續(xù)在集熱氏磁力攪拌器中105 ℃恒溫攪拌1 h，采用流變儀對天然淀粉和DBS流變學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定。選擇40 mm平板，間隙值設(shè)定為1 050，擦去多余樣品，重新設(shè)間隙值為1 000。動態(tài)流變設(shè)定程序為：振蕩頻率0.1～10，應(yīng)變2%，9 個點。靜態(tài)流變設(shè)定程序為：流動掃描，剪切速率0.1～100 s－1，6 個點。

1.3.7 水解特性分析

1.3.7.1 持水力測定根據(jù)Liu Guodong等[1]的方法對淀粉持水力進(jìn)行測定。

1.3.7.2 膨脹能力測定

用蒸餾水配制質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的淀粉乳，置于集熱式磁力攪拌器上，于105 ℃下恒溫攪拌，待完全糊化后，取10 mL乳液于離心試管中，3 000 r/min離心30 min，收集上清液，所得沉淀即為膨脹淀粉。將上清液置于表面皿中于105 ℃烘至恒質(zhì)量，得到水溶淀粉，稱質(zhì)量并記錄[13]。按式（2）、（3）計算淀粉的溶解度和膨脹能力。

式中：S為溶解度/%；m1為上清液蒸干至恒質(zhì)量后的質(zhì)量/g；m0為稱取淀粉質(zhì)量/g；m2為沉淀質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 XRD分析結(jié)果

圖 1 3 種大米淀粉（A）及其DBS（B）的XRD圖譜Fig. 1 XRD patterns of native rice starch (A) and DBS (B)

由圖1可知，3 種大米天然淀粉（IS、JS、WS）XRD峰的位置主要集中在10°～27°，在衍射角2θ為15°、17°、18°和23°時出現(xiàn)較強的特征衍射峰，這屬于典型的A型淀粉[14]，而DBS衍射峰的位置出現(xiàn)變化，DBIS、DBJS和DBWS衍射峰的位置主要集中在7.9°、13.5°、15°、17°、18°、21°和23°，表明DBS的結(jié)晶度明顯低于天然淀粉，無定形區(qū)增加，表明經(jīng)過普魯蘭酶水解后形成的晶體結(jié)構(gòu)向無定形和無序的淀粉鏈發(fā)展，進(jìn)入無序凝膠網(wǎng)絡(luò)[15-16]。DBWS在7.9°、13.5°、15°、17°、18°、21°特征衍射峰強度高于DBIS和DBJS，表明DBWS中直鏈含量明顯增多。

2.2 鏈長分布分析結(jié)果

圖 2 3 種大米淀粉的鏈長分布Fig. 2 Distribution of chain lengths of native and debranched rice starch

根據(jù)分支鏈長淀粉可分為4 種類型：A鏈：DP為6～12；B1鏈：DP為13～24；B2鏈：DP為25～36；B3鏈：DP大于37[17]。HPAEC-脈沖電流檢測器可以確定DP范圍為6～60[18-19]。采用支鏈淀粉酶選擇性水解α-1,6-糖苷鍵，將支鏈切下，得到線性短鏈淀粉。本實驗選擇3 種大米淀粉經(jīng)過支鏈淀粉酶徹底脫支，研究支鏈淀粉酶對水解淀粉分支結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響。由圖2可知，3 種DBS的精細(xì)結(jié)構(gòu)相似。DBIS含有較多長鏈淀粉分支（B2和B3鏈：27.47%），而DBWS與其他兩種大米淀粉相比，A鏈的相對含量為32.61%，所占比例較高，B2和B3鏈為22.08%，所占比例最低。DBWS的平均鏈長最短（DP為19.27），DBIS的平均鏈長最長（DP為21.34）；普魯蘭酶可以選擇性地水解α-1,6-D-糖苷鍵。以上結(jié)果表明，普魯蘭酶水解反應(yīng)對較短的支鏈更有效，鏈長越短越容易被切割，反之亦然[20]。

2.3 FT-IR分析結(jié)果

圖 3 3 種大米淀粉及其DBS的FT-IR圖譜Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of raw and debranched rice starch

由圖3可知，在天然淀粉中，通常情況下在3 385 cm－1處的寬帶歸因于—OH伸縮振動，在1 250 cm－1處的波段對應(yīng)于—OH彎曲振動[21]。3 種大米淀粉及其DBS的FT-IR光譜之間峰形沒有明顯差別，但DBS的峰強度有所增強。天然淀粉在脫支過程中α-1,6-糖苷鍵不斷被水解斷裂，—OH數(shù)量隨之增加，導(dǎo)致在3 000～4 000 cm－1處的吸收峰變得狹長，3 410 cm－1處的—OH伸縮振動吸收峰相對增強。

2.4 黏度分析結(jié)果

圖 4 3 種大米淀粉脫支前后的黏度變化趨勢Fig. 4 Trend of viscosity in raw and debranched rice starch

由圖4和表2可知，不同來源淀粉脫支前后的黏度不同。在糊化過程中，3 種大米的天然淀粉顯示出典型的布拉本德黏度曲線。WS的糊化曲線與IS和JS有較大差異；WS短時間內(nèi)達(dá)峰值黏度，之后迅速下降，在冷卻過程中譜線平緩，而IS和JS達(dá)到峰值黏度的時間略長，冷卻過程中黏度回升明顯，最終黏度高于WS。IS峰值黏度、最終黏度較高說明IS顆粒分子間締合、交聯(lián)程度較大，排列緊密，抗剪切力較強。崩解值反映了淀粉顆粒結(jié)構(gòu)在加熱過程中的穩(wěn)定性，崩解值越大淀粉顆粒越不穩(wěn)定。本實驗中JS崩解值最大，說明其淀粉顆粒熱穩(wěn)定性差，而WS呈現(xiàn)較低的峰值黏度，表明其有較高的抵抗膨脹和破裂能力[22]。WS的回生值僅為726 mPa·s，表明WS與其他兩種淀粉相比不易退化和發(fā)生分子聚集[15]。當(dāng)將普魯蘭酶添加到系統(tǒng)中時，淀粉糊黏度急劇下降。由表2可知，DBWS、DBJS和DBIS的最終黏度較其天然淀粉分別降低了94.99%、56.15%和52.84%。DBWS黏度較DBJS和DBIS下降快，表明WS對普魯蘭酶更為敏感，容易被水解。支鏈淀粉以及支鏈淀粉鏈長所占的比例，可能對淀粉糊的最終黏度具有重要影響。IS的糊化溫度最高，說明其在自然水分下加熱時晶體崩解所需熱量最低，凝膠稠度最小。WS的糊化溫度最低，說明其在自然水分下加熱時晶體崩解所需熱量最高，凝膠稠度最大，究其原因可能是直鏈淀粉含量的差異性[23-24]。為保持酶活力，淀粉糊化后加入普魯蘭酶，測定DBS黏度，溫度設(shè)定為50 ℃，溫度過高會導(dǎo)致酶活力喪失，因此DBS糊化溫度未測定。

表 2 3 種大米淀粉脫支前后的黏度變化Table 2 Viscosity change before and after debranching of rice starch

2.5 流變學(xué)特性分析結(jié)果

2.5.1 動態(tài)流變學(xué)特性分析結(jié)果

圖 5 3 種大米淀粉脫支前后的動態(tài)流變變化趨勢Fig. 5 Trend of dynamic rheology in raw and debranched rice starch

由圖5可知，3 種大米淀粉儲能模量（G’）和損耗模量（G’’）均隨著頻率的增加而上升，表現(xiàn)為典型的弱凝膠動態(tài)流變學(xué)特征，IS的黏性和彈性均為最高，WS均為最低，這可能是由直鏈淀粉含量差異導(dǎo)致的。脫支后DBS的G’和G’’整體隨頻率增加而上升，但G’最終值差異較小，而DBIS的G’’最高，DBWS最低，這與黏度分析結(jié)果相同，3 種DBS的G’和G’’都較其天然淀粉降低，說明脫支處理使凝膠強度降低，凝膠表現(xiàn)出液體特性。經(jīng)過脫支處理，淀粉分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)重組，分子鏈被切割，直鏈淀粉含量增多，分子鏈段纏繞變少，黏度降低，凝膠強度降低[25]。

2.5.2 靜態(tài)流變學(xué)特性分析結(jié)果

圖 6 3 種大米淀粉脫支前后的靜態(tài)流變變化趨勢Fig. 6 Trend of static rheology in raw and debranched rice starch

由圖6可知，3 種大米天然淀粉及其DBS的剪切應(yīng)力均隨剪切速率的增加而增大，具有假塑性流體特征；曲線均不同程度地屈向剪切應(yīng)力軸，可以判斷出其均屬于非牛頓流體；3 種大米天然淀粉的表觀黏度均在剪切速率為0～10 s－1時急劇下降，表現(xiàn)出更強的剪切稀化現(xiàn)象，經(jīng)過普魯蘭酶處理后的3 種DBS的剪切應(yīng)力和表觀黏度均比天然淀粉低，這可能是由于脫支處理后分子鏈斷裂，使分子鏈更利于流動[26-27]。2.6 水解特性分析結(jié)果

表 3 3 種大米淀粉及其DBS的水解特性Table 3 Hydrolysis characteristics of raw and debranched rice starch

由表3可知，3 種大米天然淀粉的溶解度較低，膨脹能力較高，經(jīng)普魯蘭酶脫支后溶解度增加，膨脹能力減小，究其原因可能是脫支使得直鏈淀粉含量增加，直鏈淀粉的雙螺旋結(jié)構(gòu)在淀粉糊化過程中很難破壞，因此能抑制淀粉分子的膨脹，增加其溶解度[28]。鏈長會影響持水力，鏈長越長越易凝結(jié)成塊，從而容納更多的水分。IS的持水力高于WS和JS，直鏈淀粉含量和支鏈長度是造成這種差異的主要原因。直鏈淀粉傾向于形成不溶性凝膠網(wǎng)絡(luò)，持水力差，而較長的鏈可以捕獲更多的水分形成水凝膠。相反，高度分枝支鏈淀粉不太容易重新結(jié)合[29]。因此，由于短鏈數(shù)量增加，DBS持水力提高。

3 結(jié) 論

本實驗研究結(jié)果表明，經(jīng)普魯蘭酶水解后，DBS短鏈葡聚糖鏈比例增加。與秈米和粳米淀粉相比，糯米淀粉對普魯蘭酶更為敏感，鏈長分布結(jié)果表明糯米淀粉的A鏈相對含量為32.61%，平均鏈長最短（DP為19.27），傾向于形成更短的鏈，淀粉糊黏度急劇減少，普魯蘭酶水解后形成的晶體結(jié)構(gòu)向無定形和無序的淀粉鏈發(fā)展，進(jìn)入無序凝膠網(wǎng)絡(luò)。脫支前后3 種大米淀粉FT-IR曲線沒有明顯差異，脫支后淀粉黏度、G’和G’’都有所降低，淀粉顆粒分子間締合、交聯(lián)程度變?nèi)酰帕兴缮?。天然淀粉的溶解度較低，膨脹能力較高，經(jīng)過普魯蘭酶脫支后溶解度增加，膨脹能力減小，推測鏈長會影響持水力?；谝陨辖Y(jié)果，發(fā)現(xiàn)DBS親水性強，低相對分子質(zhì)量線性短鏈淀粉相對含量增加，分子運動性增強，重新組合形成更加致密的凝膠結(jié)構(gòu)。糯米淀粉對普魯蘭酶處理較其他兩種大米淀粉更為敏感。經(jīng)過普魯蘭酶脫支后的大米淀粉增強了分子聚集和締結(jié)，在親水介質(zhì)中，DBS能快速形成凝膠結(jié)構(gòu)，抑制酶液降解，使淀粉的抗酶解能力增加，增強淀粉的流動性和壓實性能。DBS可以作為膠凝劑、混濁劑、脂肪替代品以及谷物類早餐食品的包衣等[9,30]，也可用于包埋運載藥物及活性物質(zhì)等。