張競競 劉愛慧 孫樂彤 孫建安

摘 要 以南極磷蝦粉作為培養(yǎng)基成分，研究枯草芽孢桿菌高密度培養(yǎng)的最佳工藝條件，為枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的研制奠定理論基礎(chǔ)。以枯草芽孢桿菌數(shù)目為指標(biāo)，使用單因素試驗(yàn)對培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而研究出最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明，以南極磷蝦粉為培養(yǎng)基成分培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)條件為：南極磷蝦粉濃度2.5%，接種量10%，裝液量100 mL/250 mL，pH值為8.0，發(fā)酵時間3 d。在此培養(yǎng)條件下，枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)可達(dá)到3.6×109 CFU·mL-1。

關(guān)鍵詞 南極磷蝦粉;枯草芽孢桿菌;發(fā)酵條件;高密度培養(yǎng)

中圖分類號：S963.211 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.23.054

枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動，對水產(chǎn)中的弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害微生物有很強(qiáng)的抑制作用，能有效預(yù)防水產(chǎn)動物腸炎、爛鰓等疾病;既可以分解養(yǎng)殖池中的有毒有害物質(zhì)，還可以分解池中殘餌和有機(jī)物等，具有很強(qiáng)的清理水中小顆粒垃圾的作用;具有活性較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，促進(jìn)飼料中營養(yǎng)素降解和水產(chǎn)類動物對飼料的吸收。

南極磷蝦（Antarctic krill）是生活在南大洋中的一種節(jié)肢動物門浮游動物，在南大西洋食物鏈中起到重要作用[1]。南極磷蝦是海洋中一種重要資源，它的利用受到了各國的廣泛關(guān)注[2]。因此，最大化發(fā)揮南極磷蝦的作用具有非常重要的戰(zhàn)略意義。隨著人們對南極磷蝦的開發(fā)與利用的日漸深入，各種磷蝦產(chǎn)品已經(jīng)面世，如磷蝦蛋白粉、磷蝦油等。南極磷蝦粉是南極磷蝦油提取過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)和礦質(zhì)元素等營養(yǎng)成分，是一種優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)基資源，利用微生物發(fā)酵南極磷蝦粉制備微生態(tài)制劑也是南極磷蝦粉價值體現(xiàn)的一個方向。微生態(tài)制劑在改善宿主健康上起到主要作用[3]，正在全球范圍內(nèi)的魚類和貝類養(yǎng)殖中獲得越來越高的科學(xué)價值和商業(yè)價值 。南極磷蝦這一重要資源的開發(fā)，可增加資源利用率。

通過單因素試驗(yàn)，以南極磷蝦粉為唯一營養(yǎng)成分，探討發(fā)酵時間、南極磷蝦粉濃度、接種量、發(fā)酵液pH值和發(fā)酵液裝瓶量5個因素對枯草芽孢桿菌培養(yǎng)效果的影響;以枯草芽孢桿菌的菌數(shù)為衡量指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化，為枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 原料

南極磷蝦粉，購自青島西海岸遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司;枯草芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），購自CICC（中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

SPX智能型生化培養(yǎng)箱，購自寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司;BCM-1000型超凈工作臺，購自蘇州凈化集團(tuán);QYC2112型搖床，購自上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LDZX-50KA型立式滅菌鍋，購自上海申安醫(yī)療器械廠;PL203型電子天平，購自Metteler toledo儀器公司。

1.2 培養(yǎng)條件

1.2.1 種子培養(yǎng)液條件

以自來水配制濃度為3%（w/v）的南極磷蝦粉溶液100 mL，調(diào)節(jié)其pH為8.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后冷卻，用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌。培養(yǎng)條件為：30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)速180 r·min-1。培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)液菌數(shù)應(yīng)達(dá)到1.6×109 CFU·mL-1。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)液條件

配制不同濃度的南極磷蝦粉溶液，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min作為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在不同培養(yǎng)時間、不同接種量、不同發(fā)酵初始pH和不同裝液量條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用于研究枯草芽孢桿菌最適發(fā)酵條件。

1.3 探究不同因素對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

1.3.1 南極磷蝦粉濃度對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

在5個250 mL三角瓶中分別裝入100 mL南極磷蝦粉發(fā)酵培養(yǎng)液，控制南極磷蝦粉濃度分別為1%、3%、5%、10%和15%（w/v）?？莶菅挎邨U菌的培養(yǎng)時間為

3 d，分別取培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌菌液進(jìn)行稀釋并涂布平板，每個稀釋梯度做3次重復(fù)操作，并將平板倒置于

30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后計(jì)數(shù)。試驗(yàn)平行重復(fù)3次，取其平均值，統(tǒng)計(jì)枯草芽孢桿菌的數(shù)量，分析南極磷蝦粉濃度對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響。

1.3.2 發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

在5個250 mL三角瓶中分別裝入100 mL濃度為5%（w/v）的南極磷蝦粉發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其pH為8.0。

121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，將枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)液分別以5%（v/v）的比例接入到5瓶發(fā)酵培養(yǎng)液中，分別于30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d和5 d。其他操作同1.3.1，取其平均值，統(tǒng)計(jì)枯草芽孢桿菌的數(shù)量，分析發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響。

1.3.3 接種量對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

在5個250 mL三角瓶中分別裝入100 mL5%（w/v）的南極磷蝦粉發(fā)酵培養(yǎng)液，將枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)液分別以0.5%、1%、5%、10%和15%（v/v）的比例接入到5瓶發(fā)酵培養(yǎng)液中，其他條件與操作同1.3.1，統(tǒng)計(jì)枯草芽孢桿菌的數(shù)量，分析接種量對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響。

1.3.4 發(fā)酵液pH值對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

在6個250 mL三角瓶中分別裝入100 mL 5%（w/v）南極磷蝦粉發(fā)酵培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)其pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，其他條件與操作同1.3.1，統(tǒng)計(jì)枯草芽孢桿菌的數(shù)量，分析發(fā)酵液pH值對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響。

1.3.5 發(fā)酵液裝瓶比例對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

在5個250 mL三角瓶中分別控制5%（w/v）南極磷蝦粉發(fā)酵培養(yǎng)液的裝瓶比例為12%、20%、40%、60%和80%，調(diào)節(jié)其pH值為8.0，其他條件與操作同1.3.1，統(tǒng)計(jì)枯草芽孢桿菌的數(shù)量，分析發(fā)酵液瓶裝比例對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響。

1.4 枯草芽孢桿菌活菌菌數(shù)測定

1.4.1 稀釋倒平板法

按10倍稀釋法將培養(yǎng)后的菌液制成不同濃度的稀釋液，從稀釋液中分別吸取100 ?L置于LB固體培養(yǎng)皿中，用無菌涂布棒涂布均勻，每個稀釋度做3次重復(fù)操作。將涂布后的平板倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4.2 平板計(jì)數(shù)

選擇適宜的稀釋度，菌落數(shù)在30～300個的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.3 計(jì)算方法

芽孢桿菌數(shù)（CFU·mL-1）=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦粉濃度對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

南極磷蝦粉濃度對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響如圖1所示。當(dāng)南極磷蝦粉濃度在1%～3%范圍內(nèi)時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)顯著增高;當(dāng)南極磷蝦粉濃度為2.5%時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)達(dá)到最高值，為9×109 CFU·mL-1;繼續(xù)增高南極磷蝦粉濃度時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)則顯著減少。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，南極磷蝦粉濃度對枯草芽孢桿菌菌數(shù)存在極顯著影響。試驗(yàn)以南極磷蝦粉為唯一營養(yǎng)成分，進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)。當(dāng)南極磷蝦粉的濃度過低時，由于可利用的營養(yǎng)成分過少，菌株生長不良，菌數(shù)過少;當(dāng)南極磷蝦粉的濃度過高時，培養(yǎng)基中的含水量過少，對微生物的生長及代謝能力產(chǎn)生不利的影響。因此，于本研究條件下，枯草芽孢桿菌生長所需的南極磷蝦粉適宜濃度為2.5%。

2.2 發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響如圖2所示。發(fā)酵時間為1～3 d時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)極速增長，為增長期;當(dāng)發(fā)酵時間到3 d時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)達(dá)到3.5×109 CFU·mL-1;發(fā)酵時間4～5 d時，枯草芽孢桿菌生長進(jìn)入緩慢增長期，菌數(shù)增長緩慢;結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的適宜發(fā)酵時間為3 d。

2.3 接種量對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

接種量對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響如圖3所示?？莶菅挎邨U菌菌數(shù)在接種量為0.5%～10%的范圍內(nèi)隨接種量的增大而極顯著增大，最大值為5.5×109 CFU·mL-1;當(dāng)接種量超過10%時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)則極顯著減少。試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的適宜接種量為10%。

2.4 發(fā)酵液pH值對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

發(fā)酵液pH值對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響如圖4所示。當(dāng)發(fā)酵液的pH值在5.0～8.0范圍內(nèi)時，隨著pH值的升高，菌數(shù)極顯著增多;pH值為8.0時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)達(dá)最高值為3.4×109 CFU·mL-1;當(dāng)pH值高于8.0后，枯草芽孢桿菌菌數(shù)極顯著減少。這一結(jié)果表明，發(fā)酵液偏酸或偏堿都不利于枯草芽孢桿菌的生長，枯草芽孢桿菌生長的適宜pH值為8.0。

2.5 發(fā)酵液裝瓶比例對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響

發(fā)酵液裝瓶比例是通過影響溶氧量對枯草芽孢桿菌的生長產(chǎn)生影響的，發(fā)酵液中的溶氧量大小直接影響著菌株的呼吸代謝。發(fā)酵液裝瓶比例對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響如圖5所示。當(dāng)發(fā)酵液裝瓶比例為40%時，枯草芽孢桿菌菌數(shù)達(dá)到最高值為3.6×109 CFU·mL-1。發(fā)酵液裝瓶量少，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)數(shù)量少，不利于菌體生長;反之，裝瓶量大，可能影響容器中的氧含量。由于枯草芽孢桿菌是好氧菌，故容器中的氧含量減少不利于菌體生長。試驗(yàn)結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌生長的適宜發(fā)酵液裝瓶比例為40%。

3 結(jié)論

以南極磷蝦粉為原料進(jìn)行研究，基本實(shí)現(xiàn)了對培養(yǎng)枯草芽孢桿菌工藝的優(yōu)化，可以提高南極磷蝦的利用價值。通過多個單因素試驗(yàn)，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，從而得出單一變量中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的最適宜條件為：南極磷蝦粉濃度2.5%，接種量10%，pH值8.0，發(fā)酵時間3 d，發(fā)酵液裝瓶比例40%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃洪亮，陳雪忠，馮春雷.南極磷蝦資源開發(fā)現(xiàn)狀分析[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2007，34（1）：48-51.

[2] Delgado GTC， Tamashiro WMDSC， Junior MRM， et al. The putative effects of prebiotics as immunomodulatory agents[J].Food Research International，2011，44（10）：3167-3173.

[3] 胡珊，胡事君，吳清平，等.益生菌制劑加工技術(shù)的研究概況[J].中國乳品工業(yè)，2010，38（3）：47-50.

（責(zé)任編輯：劉昀）