李康梅 陳秀榕 戴明明 黎明星 黃愉淋 白琳 吳媛媛 何國珍

1廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院（南寧530200）；2廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（南寧530023）；3廣西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院（南寧530001）

卵巢的卵泡由卵母細胞、顆粒細胞及膜細胞組成，睪丸由生精小管和生精小管之間的睪丸間質組成，支持細胞、睪丸間質細胞及肌樣細胞為其主要生殖細胞。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）為多肽生長因子，肝細胞生長因子受體（HGF-receptor，也稱c-Met）為HGF 唯一的受體，二者通過特異性結合，可調控性腺發(fā)育以及生殖細胞的增殖，促進胎盤滋養(yǎng)細胞、血管內皮細胞、肝細胞等多種細胞的增殖以及侵襲。本綜述主要對HGF/c-Met 信號通號通路調控生殖細胞發(fā)生的研究進展進行概括。

1 HGF/c-Met 信號通路

HGF 最早從大鼠的血漿中發(fā)現，主要源自肝臟的儲脂細胞，可強烈刺激肝細胞DNA 的合成，后又因能刺激原代培養(yǎng)肝細胞的生長與分化，被稱為HGF［1-2］。HGF 為多肽生長因子，前體為單鏈無活性蛋白，由一條728 個氨基酸編碼而成，經絲氨酸蛋白水解酶水解，再由二硫鍵連接，最終形成具備活性的雙鏈分子（由α-β鏈組成的一個異質二聚體）［3-4］（圖1）。α鏈較長，含有一個典型的信號肽，在分泌過程中裂解形成5 個結構域：與纖溶酶原激活肽同源的一個N 端發(fā)夾環(huán)結構域（N）與4 個環(huán)狀結構域（K）；β鏈較短，與典型的絲氨酸蛋白酶結構域相似［5］。

圖1 HGF 的結構圖［6］Fig.1 Molecular structure of the HGF［6］

c-Met 是受體酪氨酸激酶的獨特亞家族，由原癌基因MET 編碼產生，具備自主磷酸化活性；主鏈前體蛋白為Ⅱ型酪氨酸激酶受體，以二硫鍵結合α 和β 兩個亞基所組成單鏈構成主要結構，包含細胞外配體結合區(qū)、細胞內胞質蛋白激酶結構區(qū)以及跨膜螺旋結構。c-Met 蛋白的細胞外區(qū)域（圖2）由3 個功能區(qū)域組成：包含所有α 亞基和β 亞基N端部分β 螺旋折疊區(qū)域（Scma domain）、含4 個二硫鍵的富胱氨酸結構域（plcxins，scmaphorins and intcgrins domain）、與跨膜螺旋區(qū)相連接的4 個免疫球蛋白樣結構域（immunoglobulin-plcxin-transcription domain）；β 亞基的細胞內區(qū)具有酪氨酸激酶活性并能轉換HGF 的所有效應。c-Met 蛋白的細胞內區(qū)則由近膜結構區(qū)、激酶催化結構區(qū)及C-末端結構區(qū)組成，近膜結構域有2 個磷酸化位點，參與c-Met 表達的下調和內化；酪氨酸激酶催化位（Tyr1235、Tyr1234 以及Tyr1230）通過磷酸化能正向調控酶的活性；C-末端結構域包含一個獨特的結合位點，其中的Tyr1349 與Tyr1356 磷酸化能吸引多種信號轉導蛋白和適配蛋白，進而激活多條下游信號通路［4，7］。

圖2 c-Met 結構圖［8］Fig.2 Molecular structure of the c-Met［8］

HGF 與c-Met 通過兩個激酶位點產生特異性結合，一個是經過泛素連接酶（casitas B-lineage lymphoma，CBL）與酪氨酸激酶催化區(qū)（tyrosine kinase domain；consist of tyr 1234 and tyr1235，TKCD）結合，分泌泛素化酶，激活HGF-c-Met-CBL 通路的負調節(jié)作用，抑制c-Met 及其他下游受體酪氨酸激酶的活性［4，9］；另一個則利用有SH2 結構域的多效應物質與位于Met 尾端的多功能激酶位點相結合，所形成的c-Met 復合物，再與如磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）、IκBα-NF-κB 復合物、生長因子受體結合蛋白-2（Grb2-associated binder2，Gab2）等直接或間接結合，啟動相應的信號通路，發(fā)揮細胞的增殖、侵襲能力等作用［4，10］。c-Met 與HGF 結合后，酪氨酸激酶活性被激活，產生二聚化，c-Met 胞質內酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化，胞質內的蛋白激酶結構區(qū)的酪氨酸激酶被激活，為下游信號傳導底物（Src、Gabl、Gab2）提供停泊位點，激活如PI3K/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threoninespecific protein kinase，AKT），Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，Ras）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等信號通路（圖3）［11-12］，并把增殖信號傳遞至細胞核，調控特定基因的表達，促進細胞的分裂增殖、分化、遷移、形態(tài)發(fā)生、蛋白質合成以及血管生成等［13］。HGF 表達于周圍間質細胞，c-Met 則多表達于上皮來源細胞［3，7］，對胎盤滋養(yǎng)細胞、卵泡發(fā)生相關細胞（如卵泡膜細胞、顆粒細胞等）、血管內皮細胞、肝細胞等多種細胞增殖有調節(jié)作用。在胚胎期與成人期均可在多個器官如肝臟、胰腺、前列腺中檢測出c-Met，其表達對胎盤、肝、腎、腦等的正常發(fā)育及造血功能有重要影響［8］。

2 HGF/c-Met 信號通路對卵泡發(fā)生的調控

卵泡作為哺乳動物卵巢組織的基本功能單位，包含有膜細胞、上皮衍生的顆粒細胞以及周圍的基質細胞所圍繞的卵母細胞。卵泡發(fā)生是一個連續(xù)數周的進程，相繼經歷原始卵泡、初級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡幾個階段。始于原始卵泡被激活，后募集一個或多個原始卵泡到生長卵泡庫，細胞增大并增殖，最終止于排卵或者卵泡閉鎖。通常將該進程劃分為促性腺激素不依賴階段與促性腺激素依賴階段。

卵泡發(fā)生有著精密的時序調控。優(yōu)勢卵泡排卵后，卵泡破裂排出后，卵巢表面上皮的損傷以及殘留在卵巢內的部分分化成為黃體。整個卵泡發(fā)生的過程實際上是一個持續(xù)進行的包含血管發(fā)生、損傷修復以及衰退的組織生長過程。HGF/c-Met 信號通路可能直接作用于血管內皮細胞調節(jié)血管形成、提高毛細血管密度及血流速度來影響損傷的修復，并影響胚胎的發(fā)育［14-15］。雖然哺乳動物卵巢的顆粒細胞不含血管，但膜細胞層外有豐富的血管，膜細胞外的血管發(fā)育與卵泡發(fā)育有較大聯系。此外，HGF 與c-Met 還在多種動物如大鼠、豬、牛以及人類的前列腺、睪丸、子宮內膜、膜細胞、顆粒細胞內有不同程度表達，HGF 可通過自/旁分泌調節(jié)膜細胞和顆粒細胞的增殖，HGF 在卵巢的表達與妊娠率低、女性性腺疾病發(fā)病相關，還可能影響卵泡發(fā)生［14，16］。

圖3 HGF/c-Met 信號通路圖［8］Fig.3 Molecular of the HGF/c-met signaling pathway

2.1 HGF/cMet 信號通路與卵泡膜細胞研究發(fā)現HGF 與c-Met 在人卵泡膜細胞和顆粒細胞上表達，HGF 可能直接通過改變類固醇形成基因近而調節(jié)膜細胞雄激素和孕酮的分泌［17］。在卵泡發(fā)生的早期啟動中，HGF 可直接作用于膜細胞，但對膜細胞分泌類固醇激素調節(jié)是間接的［18-19］。將絨毛膜促性腺激素作用于未成熟大鼠，可提高HGF 與c-Met 在囊狀卵泡膜細胞上的表達［5］。HGF 還可促進生殖細胞分化以及由間質細胞衍生的膜細胞分泌，在卵泡發(fā)育期間刺激上皮顆粒細胞增殖［16］。

2.2 HGF/c-Met 信號通路與顆粒細胞顆粒細胞可通過分泌多種生長因子、信號轉導因子、旁分泌因子等來調控卵母細胞的成熟。最早報道HGF 在卵巢中的效應是其可誘導體外培養(yǎng)的牛顆粒細胞的增殖，并且有研究發(fā)現HGF 及其受體c-Met 的mRNA 在人排卵前卵泡顆粧細胞中表達［3］。HGF與c-Met 在小鼠早期卵巢就有表達，隨年齡增大c-Met 表達逐漸增強，HGF 增強不明顯，與干細胞因子/KIT 配體（KIT ligand）相互作用可促進顆粒細胞的增殖和早期卵泡發(fā)生［17］。 HGF 可正向調控顆粒細胞增殖與分化，抑制卵泡的閉鎖，并可表達在不成熟的大鼠卵巢的竇前卵泡間質膜細胞和顆粒細胞中，促進竇前卵泡間質膜細胞分泌孕酮，但抑制了雄激素的產生，表明HGF 可逆性的抑制由黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）刺激的雄激素的產生從而促進卵泡發(fā)生［19-20］。

2.3 HGF/cMet 信號通路與卵泡發(fā)生機制卵泡發(fā)生過程伴隨著卵巢顆粒細胞和膜細胞的增殖和分化，產生各種卵巢局部生長因子，建立并維持卵母細胞成熟所需要的局部微環(huán)境。HGF 為旁分泌調節(jié)因子，對間質細胞來源的膜細胞和上皮性的顆粒細胞的相互影響有重要的意義，HGF 和c-Met可同時促進膜細胞和顆粒細胞的發(fā)育［16］。在未成熟大鼠卵巢中，應用免疫組化發(fā)現c-Met 在小的腔前卵泡的顆粒細胞中表達最強，在用孕馬血清作用誘導囊狀卵泡的生長之后，HGF 與c-Met 的表達顯著轉變，在顆粒細胞的表達相對下降，但在囊狀卵泡外的膜細胞的表達相對增高［18］，表明HGF 與c-Met 不僅可表達在顆粒細胞和膜細胞，同時二者的表達水平受體內激素的影響。膜細胞所分泌的HGF、轉化生長因子（transforming growth factoralpha，TGF）、角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor）等因子。雌激素和促性腺激素可以刺激這些細胞因子的表達，表明激素和局部的旁分泌因子都是通過調節(jié)細胞之間的相互作用，從而調節(jié)或刺激原始卵泡的發(fā)生以及發(fā)育［16，21］。

ZACHOW 等［22］研究顯示，卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和HGF 均可各自降低體外培養(yǎng)大鼠顆粒細胞上c-Met 的表達，相反，環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate）則可增加c-Met 的表達程度。c-Met 在體外受精成功的卵母細胞顆粒細胞的表達遠比受精不成功的卵母細胞顆粒細胞要強，提示HGF/cMet 信號通路可能是卵母細胞成熟并能受精成功的一個重要因素［23］。

3 HGF/cMet 信號通路對精子發(fā)生的調控

精子發(fā)生根據細胞增殖和分化特征分為3 個時期：（1）有絲分裂期：原始生殖細胞多次有絲分裂分化成為精原細胞；（2）減數分裂期：精原細胞再分化形成精母細胞，精母細胞又通過減數分裂形成圓形精子細胞；（3）精子形成期：圓形精子細胞變態(tài)分化形成蝌蚪狀的精子，此時的精子已經具有一定的運動能力。精子從生精小管上皮釋放進入管腔，再進入附睪繼續(xù)發(fā)育，最終發(fā)育為成熟精子。

精子發(fā)生的主要受激素和旁分泌因子兩方面調節(jié)。一是通過下丘腦-垂體-睪丸軸來調節(jié)精子發(fā)生的啟動和維持，下丘腦分泌促性腺激素釋放激素，刺激垂體分泌的FSH 和LH，LH 又促使睪九間質細胞分泌的睪酮，最終調節(jié)精子的發(fā)生。二是通過激素受體和受體后信號轉導，局部的旁分泌、自分泌激素以及生長因子（如HGF、FGFs 等）調節(jié)精子發(fā)生。

HGF 為多生物學效應的生長因子，能夠促進細胞遷移、增殖以及血管生成［24-25］。HGF/c-Met信號通路在睪丸發(fā)育的所有階段均有活躍的表達［22，26］。HGF 為自/旁分泌生長因子，可調節(jié)機體的內分泌狀態(tài)，可直接作用于男性生殖細胞，或間接對睪丸管狀細胞和間質體細胞產生作用。HGF 可促進胎兒和成人睪酮的分泌。在離體培養(yǎng)的支持細胞系中加入外源性HGF 能夠培養(yǎng)出類管樣組織，猜測這可能與HGF 促分化和促血管形成的功能有關［27］。在嚙齒類動物中，胎兒的男性化和血漿雄激素（睪酮）的增加發(fā)生在下丘腦-垂體-睪丸軸發(fā)揮作用之前。轉基因缺乏促黃體生成素受體小鼠在出生時仍呈現正常的睪丸表型雄激素水平，表明在下丘腦-垂體-睪丸軸產生正常的生理作用之前，胚胎雄性睪酮的增加以及胎兒睪丸間質細胞的分化，主要受局部生長因子的調控，HGF 極有可能參與其中［12，28］。

3.1 HGF/cMet 信號通路與睪丸間質細胞睪丸間質細胞能合成和分泌雄激素-睪酮，調控精子發(fā)生過程［29］。睪丸間質細胞的凋亡或消失會造成雄性激素能力低下［30］。在胚胎形態(tài)發(fā)生時，HGF 在上皮-間充質相互作用中發(fā)揮重要作用。HGF 可誘導間充質細胞轉化，并使間質細胞分泌得睪酮量顯著增加，降低睪丸間質細胞凋亡，可能與HGF抑制caspase-3 的活性有關［11，13，31］。此外，HGF 還可促使間質細胞分泌蛋白酶，提高TGF-β的活性，調控支持細胞之間緊密連接，影響血-睪屏障的形成［27］。在離體實驗培養(yǎng)的睪丸間質細胞中，發(fā)現HGF 能刺激睪酮合成，促進胚胎睪丸間質細胞發(fā)育并延長睪丸間質細胞的存活［11，31］。

3.2 HGF/cMe 信號通路與肌樣細胞肌樣細胞圍繞在生精小管周圍，負責管狀收縮，幫助運送非活動精子進入附睪，其發(fā)育依賴于雄激素作用，可分泌因子調控精子發(fā)生和睪丸的發(fā)育。肌樣細胞系是發(fā)現HGF/c-Met 系統(tǒng)的第一個分離的睪丸細胞類型，HGF 在胚胎時期和出生后的肌樣細胞中均有表達［22］，但c-Met 僅在出生后的肌樣細胞中檢測到，表明在胚胎發(fā)育過程中有旁分泌作用，在出生后的睪丸中有旁分泌/自分泌作用［1-2］。文獻［27］顯示在HGF 的存在下培養(yǎng)的肌樣細胞，形態(tài)從圓形的、致密的形狀轉變?yōu)槔L的、擴大的形狀，HGF 還可激活睪丸肌樣細胞骨架重構和收縮，提高純化的睪丸肌樣細胞尿激酶型纖溶酶原激活物和尿激酶型纖溶酶原激活物受體的表達水平，提示HGF 作為肌樣細胞功能的自分泌調節(jié)因子，可能是哺乳動物睪丸功能的調控因子。

3.3 HGF/cMet 信號通路與精子發(fā)生機制c-Met廣泛表達于人和嚙齒動物的生精細胞［11］。HGF/c-Met 信號通路可通過影響內分泌信號，參與生精細胞凋亡的調控。c-Met 在大鼠精子發(fā)生全程中持續(xù)表達，離體實驗表明，HGF 可調控生殖細胞有絲分裂，顯著促進增加8 ～30 d 齡的大鼠睪丸精原細胞的增殖，并參與出生后睪丸生殖細胞的代謝活動的調節(jié)，調節(jié)睪丸生殖細胞的增殖并阻止生殖細胞凋亡過程［22］。精子發(fā)生在睪丸，成熟于附睪，檢測HGF 在大鼠附睪中的表達水平，在遠端的附睪體、附睪尾中表達最高，其次是近端的附睪體，但在附睪頭、輸精管以及睪丸中幾乎不表達，提示哺乳動物附睪內精子獲能可能與HGF相關［12，32］。

4 結語與展望

目前對于卵子發(fā)生和精子發(fā)生的調控機制的研究很多，但其機制仍然未闡明，特別是對于原始卵泡的啟動募集機制以及精原細胞增殖啟動機制的研究。綜上所述，HGF/c-Met 信號通路可通過調控生殖細胞的增殖和分化調控卵子發(fā)生和精子發(fā)生，通過對這條信號通路的研究以及其他自/旁分泌因子研究，有望闡明原始卵泡啟動募集和精原細胞啟動機制，為不孕不育、多囊卵巢綜合征以及卵巢早衰等性腺疾病以及其他非性腺疾病的發(fā)病機制和治療提供理論依據。