敖楠楠，馬曉麗，才謙，曲揚(yáng)，鄭彧

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600)

糖尿病已成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后，威脅人類健康的第三大殺手[1]，全世界糖尿病患者已經(jīng)超過3 億[2]，其中2型糖尿病的發(fā)病率占糖尿病發(fā)病率的90%以上，預(yù)防糖尿病已成為全世界共同關(guān)注的課題。目前臨床上常用的口服降血糖藥雖然在降血糖方面有一定功效，但大多存在副作用[3]。因此，尋找高效、無毒副作用的天然降糖藥物及保健食品尤為必要。綠茶，又稱不發(fā)酵茶，作為我國傳統(tǒng)飲品具有多種保健功能。有關(guān)茶葉降血糖的研究已有近30年的歷史?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，茶葉中的茶多酚、茶多糖等對(duì)血糖的升高有一定的抑制作用[4-7]。桑葉異名鐵扇子，為桑科植物桑(MorusablaL.)的葉子。桑葉中含有多種生物活性成分，除傳統(tǒng)藥用價(jià)值外，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，桑葉具有降血壓、降血糖、降低膽固醇、抗過敏、抗腫瘤等作用[8]。玉米須(Stigmamaydis)為禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩赘稍锏幕ㄖ椭^?，F(xiàn)代藥理研究表明它具有顯著的利尿、降血糖、抑菌、降壓、增強(qiáng)免疫、抗癌等功效[9]。

茶葉、桑葉、玉米須均具有產(chǎn)量大、經(jīng)濟(jì)、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)利用茶飲傳統(tǒng)提取方法以及中藥傳統(tǒng)提取方法，通過控制單因素試驗(yàn)，以α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到最佳提取工藝，為降糖代茶飲及保健品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備 SPD-10AVP紫外檢測器(日本島津公司)； AE240十萬分之一分析天平(瑞士MettLer公司)；AY220電子天平(日本島津公司)；手動(dòng)可調(diào)式移液器(百靈威科技有限公司)； KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(功率：300 W，頻率：50 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；石英比色皿(宜興市亮光高科分析儀器廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 材料與試劑 綠茶(西湖龍井)；桑葉(安徽)；玉米須(安徽)；α-葡萄糖苷酶(批號(hào)：SLBQ6215V，美國Sigma公司)；α-淀粉酶(批號(hào)：9000-90-20，美國BR公司)；對(duì)硝基酚-α-D葡萄糖吡喃苷(批號(hào)：E630033，阿拉丁)；還原型谷胱甘肽(批號(hào)：L1323014，阿拉丁)；可溶性淀粉(批號(hào)：20140910，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；拜唐蘋(阿卡波糖片，批號(hào)：BJ24274，拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；無水乙醇(分析純)；酒石酸鉀鈉(批號(hào)：G1727039，阿拉丁)；苯酚(分析純)；3,5-二硝基水楊酸(批號(hào)：C1729057，阿拉丁)；氫氧化鈉(分析純)；PBS緩沖溶液(批號(hào)：20170411，Solarbio公司)；娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 水泡液樣品制備 稱取適量綠茶、桑葉、玉米須原藥材，置于250 mL錐形瓶中，加入沸水100 mL，蓋上塞子，浸泡一定時(shí)間，制成水泡液，考察降糖活性。

2.1.2 水煎液樣品制備 稱取適量綠茶、桑葉、玉米須原藥材，置于250 mL燒杯中，加水100 mL，加熱至沸騰后計(jì)時(shí)，煎煮一定時(shí)間后關(guān)火，補(bǔ)足失重，制成水煎液，考察降糖活性。

2.1.3 DNS試劑配制 精密稱取酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸0.63 g，氫氧化鈉2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌至溶解，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL棕色容量瓶中，室溫保存，備用。

2.1.4 陽性對(duì)照藥的制備 取阿卡波糖片一片(規(guī)格：每片含阿卡波糖50 mg)，研碎，置于10 mL容量瓶中，加入蒸餾定容至10 mL，作為陽性對(duì)照藥，備用。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn) 按表1精密吸取磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、 谷胱甘肽(GSH)、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、待測茶飲，置于37 ℃水浴恒溫5 min,在對(duì)應(yīng)的試管中加入α-葡萄糖苷酶，37 ℃水浴恒溫20 min,以無水乙醇終止反應(yīng)，于400 nm處測吸光度值，按照公式計(jì)算抑制率。

表1 α-葡萄糖苷酶實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

抑制率(%)=(A空白管-A空白對(duì)照管)-(A抑制管-A背景對(duì)照管)/(A空白管-A空白對(duì)照管)×100%

2.3 α-淀粉酶抑制試驗(yàn) 按照表2精密吸取PBS緩沖溶液于試管中，加入α-淀粉酶與待測茶飲，于37 ℃水浴10 min，加入1%的可溶性淀粉，37 ℃水浴5 min，加入DNS試劑，100 ℃水浴10 min，迅速冷卻，加入5 mL蒸餾水，于540 nm下測定吸光度值，按照公式計(jì)算抑制率。

表2 α-淀粉酶實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

抑制率(%)=(A空白管-A空白對(duì)照管)-(A抑制管-A背景對(duì)照管)/(A空白管-A空白對(duì)照管)×100%

2.4 單因素水泡液試驗(yàn)

2.4.1 料液比試驗(yàn)

2.4.1.1 料液比考察 各稱取適量綠茶、桑葉、玉米須，置于250 mL錐形瓶中，加入沸水100 mL，蓋上塞子，水泡30 min，作為單品溶液，進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)和α-淀粉酶抑制試驗(yàn)，考察降糖活性，結(jié)果見表3～5。

表3 綠茶不同料液比水泡飲降糖活性結(jié)果

根據(jù)料液比考察結(jié)果可看出，綠茶單味藥在料液比為1∶400的條件下，桑葉單味藥在料液比為1∶20的條件下，α-葡萄糖苷酶的抑制活性較好，但對(duì)α-淀粉酶的抑制作用不明顯，當(dāng)再減小料液比，抑制作用并無較大提高，同時(shí)，可看出綠茶的降糖活性優(yōu)于桑葉。因此，篩選1∶400為綠茶最佳料液比，1∶20為桑葉的最佳料液比。 而從表5看出，玉米須的降糖活性遠(yuǎn)小于綠茶和桑葉，玉米須對(duì)于α-葡萄糖苷酶無抑制作用，對(duì)α-淀粉酶有抑制作用，從α-淀粉酶抑制活性篩選出玉米須的最佳料液比為1∶20。

表4 桑葉不同料液比水泡飲降糖活性結(jié)果

表5 玉米須不同料液比水泡飲降糖活性結(jié)果

2.4.2 浸泡時(shí)間考察 在料液比基礎(chǔ)上，綠茶按照料液比1∶400、桑葉按照料液比1∶20、玉米須按照料液比1∶20投料，置于250 mL錐形瓶中，加入沸水100 mL，蓋上塞子，浸泡30 min，作為單品溶液，進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)和α-淀粉酶抑制試驗(yàn)，考察降糖活性，結(jié)果見表6～8。

表6 綠茶不同水泡時(shí)間降糖活性結(jié)果

表7 桑葉不同水泡時(shí)間降糖活性結(jié)果

根據(jù)浸泡時(shí)間考察結(jié)果可看出，綠茶單味藥在水泡30 min條件下，桑葉單味藥在水泡30 min條件下，α-葡萄糖苷酶的抑制活性較好，但對(duì)α-淀粉酶的抑制作用不明顯，當(dāng)再減小料液比，抑制作用并無較大提高，同時(shí)，可看出綠茶的降糖活性略優(yōu)于桑葉，玉米須的降糖活性遠(yuǎn)小于綠茶和桑葉，且玉米須對(duì)α-葡萄糖苷酶無抑制作用。因此，篩選水泡時(shí)間為30 min。

表8 玉米須不同水泡時(shí)間降糖活性結(jié)果

2.4.3 提取方法考察 根據(jù)水泡液不同料液、水泡時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與傳統(tǒng)水煎液進(jìn)行對(duì)比。綠茶按照料液比1∶400、桑葉按照料液比1∶20、玉米須按照料液比1∶20投料，置于250 mL錐形瓶中，加入蒸餾水100 mL煎煮一定時(shí)間，結(jié)果見表9。

表9 單品煎煮液對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用

根據(jù)水煎液的降糖活性可看出，綠茶單味藥采用煎煮法降糖活性略有下降，而桑葉的降糖活性無明顯變化，玉米須的降糖活性略有提高，且表現(xiàn)出了對(duì)α-葡萄糖苷酶有較少的抑制作用。相同的30 min的水煎液與水泡液比較，得到水泡液的效果略優(yōu)于水煎液，且水泡法作為傳統(tǒng)茶飲的提取方式，較水煎液方便可行。因此，篩選水泡法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 組合試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果以及提取工藝考察結(jié)果，將單品最優(yōu)組進(jìn)行組合，考察降糖活性，確定最佳組合比例，結(jié)果見表10。

表10 不同代茶飲水泡試驗(yàn)及結(jié)果

根據(jù)組合試驗(yàn)結(jié)果可看出，桑葉與綠茶聯(lián)用后，對(duì)于α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用均有提高，而玉米須、桑葉、綠茶聯(lián)合使用組與桑葉、綠茶聯(lián)合使用組結(jié)果相似，可知玉米須在代茶飲中作用不強(qiáng)，因此，無須加入玉米須。采用拜唐蘋(阿卡波糖片)作為陽性對(duì)照組，拜唐蘋(阿卡波糖片)作為臨床上常用的化學(xué)藥，已廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療。從本試驗(yàn)結(jié)果可看出，拜唐蘋(阿卡波糖片)對(duì)于α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶均有較好的抑制作用，且對(duì)α-淀粉酶的抑制活性略好于α-葡萄糖苷酶。從結(jié)果看出，單味代茶飲以及組合代茶飲的α-葡萄糖苷酶的抑制活性略優(yōu)于拜唐蘋(阿卡波糖片)組。根據(jù)以上結(jié)果可知，代茶飲的降糖活性略優(yōu)于陽性對(duì)照組。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)代研究表明，茶葉中的茶多酚、茶多糖、茶色素、維生素以及某些礦物元素等對(duì)血糖的升高有一定的抑制作用，綠茶中的茶多酚具有保護(hù)胰島β細(xì)胞、抗氧化、清除自由基的功能[12]。臨床上對(duì)于糖尿病的治療多采用化學(xué)藥物，化學(xué)藥對(duì)于人體有不同程度的副作用。因此，采用我國傳統(tǒng)藥物治療糖尿病已成為熱點(diǎn)話題。糖尿病從中醫(yī)理論角度，屬中醫(yī)“消渴”范疇，消渴病的病機(jī)主要在于陰津虧損，燥熱偏盛，而以陰虛為本，燥熱為標(biāo)，兩者互為因果，陰愈虛則燥熱愈盛，燥熱愈盛則陰愈虛[13]。桑葉性微寒，乃手、足陽明之藥，歸肺肝經(jīng)，止消渴，能治療消渴癥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明桑葉提取物通過抑制小腸α-糖苷酶的活性，可降低餐后血糖的作用，且安全性較高[14]。綠茶、桑葉是中國傳統(tǒng)飲料，本試驗(yàn)通過體外試驗(yàn)對(duì)比了綠茶、桑葉及組合茶飲的降糖作用,通過α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)舍棄了對(duì)α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶作用都不明顯的玉米須，優(yōu)選出最佳茶飲配伍。

綜上試驗(yàn)結(jié)果，篩選出最佳的代茶飲為綠茶0.25 g，桑葉5 g加100 mL沸水泡30 min，不加玉米須。由以上結(jié)果可看出，代茶飲降糖作用主要是由于對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。同時(shí)可看出，該代茶飲的降糖活性略高于常用化學(xué)藥物拜唐蘋(阿卡波糖片)，因此，具有深入研究的意義。在后續(xù)工作中，將通過藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入研究桑葉、綠茶降糖機(jī)制，添加或替換藥物來增加茶飲的藥效,詳細(xì)研究茶飲的副作用，并且考慮多指標(biāo)因素的影響，得出更為科學(xué)準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果，為開發(fā)新型降糖藥奠定基礎(chǔ)。