熊瀚 林睿 唐韋竹 蒙清貴 張慶云 陳陽 程繼文

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科；2廣西醫(yī)科大學研究生院；3廣西醫(yī)科大學基因組與個體化醫(yī)學研究中心；4廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科

前列腺癌（prostate cancer，Pca）是男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在男性惡性腫瘤中居第1位，死亡率居第5位［1］。我國前列腺癌發(fā)病率較低，但呈逐年上升趨勢，目前發(fā)病率位居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第1位［2］。前列腺癌發(fā)病的危險因素有年齡、種族和遺傳等［3］。前列腺癌發(fā)病風險亦與SNP有關(guān)，迄今通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（genomewide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)與前列腺癌發(fā)病相關(guān)的SNP數(shù)量達170余個，其中多數(shù)為歐美人群的研究結(jié)果［4］。中國人群的GWAS研究發(fā)現(xiàn)rs817826位點和rs103294位點與前列腺癌發(fā)病有關(guān)［5］。

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1（low density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP1） 有內(nèi)吞細胞外蛋白酶和信號傳遞作用，參與脂蛋白代謝、細胞代謝和運動等多種生物過程［6］。研究發(fā)現(xiàn)LRP1可通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）和MMP9表達，促進癌細胞遷移和侵襲［7］。前列腺癌組織中亦發(fā)現(xiàn)LRP1基因突變重排［8］。本課題組前期研究［9］發(fā)現(xiàn)LRP1基因在前列腺癌組織中突變率為23.1%。本研究進一步從LRP1基因的SNP及其表達量探討LRP1基因?qū)η傲邢侔┌l(fā)生的影響。

1 材料與方法

1.1 LRP1基因SNP信息

本研究共納入9個與LRP1基因有關(guān)的SNP，包括本研究前期在26例前列腺癌患者全外顯子基因測序中的致病SNP 2個［9］，以及在GWAS Catlog網(wǎng)站（https：//www.ebi.ac.uk/gwas/）搜集LRP1基因在不同關(guān)聯(lián)研究中差異有統(tǒng)計學意義的SNP 7個（P＜5×10-8）。SNP基本信息見表1。

表1 LRP1基因SNP的基本信息Tab.1 Basic information of LRP1 gene SNP

1.2 SNPs的選擇

中國前列腺癌遺傳學協(xié)會（Chinese consortium for prostate cancer genetics，ChinaPca）對來自中國東部和南部9所醫(yī)院或大學的前列腺癌患者進行全基因組關(guān)聯(lián)研究。病例組為確診的前列腺癌患者；對照組為未患前列腺癌且前列腺特異性抗原（PSA）＜4 ng/mL，直腸指檢陰性，一級親屬未患前列腺癌的社區(qū)人群。兩組研究對象均抽取靜脈血液進行DNA樣本測序。采用IlluminaHumanOmniExpress微珠芯片對病例組1497例患者和對照組1 008名志愿者的731 458個SNP進行基因分型。采用標準的質(zhì)量控制程序選擇樣本并分析SNPs：若樣本總體基因分型百分比＜95%，性別不明，重復樣本或樣本間有家族關(guān)系，則排除該樣本；若SNP檢出率＜95%，最小等位基因頻率（MAF）＜0.05或?qū)φ战M間的哈迪-溫伯格平衡試驗P＜0.001，則排除該SNP。經(jīng)質(zhì)量控制分析，病例組納入1417例，對照組1 008名，共587 292個SNP。ChinaPca數(shù)據(jù)的詳細描述見文獻［5］，本研究數(shù)據(jù)來自上述質(zhì)量控制后的測序數(shù)據(jù)。

1.3 免疫組化法檢測LRP1在Pca組織中的表達

1.3.1 標本來源 收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2015年至2016年腹腔鏡下前列腺癌根治術(shù)后有完整臨床病理資料的12例前列腺癌組織標本（前列腺癌組），癌旁正常組織（距離癌組織≥3 cm）18例（癌旁正常組），以及在B超引導下經(jīng)直腸或會陰前列腺穿刺術(shù)的前列腺炎組織4例（前列腺炎組）。癌旁正常組患者平均年齡64.4歲（46～78歲），前列腺癌組64.9歲（46～78歲），前列腺炎組68歲（49～80歲）。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（審批號：20160304-12），患者簽署知情同意書。

1.3.2 免疫組化檢測 前列腺組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，4 μm厚切片，分別滴加一抗兔抗人單克隆抗體LRP1（購自英國abcam公司）和DAB顯色劑進行 DAB染色，置于顯微鏡下觀察。LRP1陽性著色部位主要位于細胞膜和細胞質(zhì)，部分細胞核染色。計數(shù)被染色細胞，于200倍顯微鏡下觀察免疫組化染色。染色陽性細胞數(shù)占0～10%，計0分；占 11%～25%，計 1分；占 26%～50%，計 2分；占51%及以上，計3分。染色強度評定：細胞完全無著色計0分，淺黃色計1分，黃色計2分，深棕黃色計3分。免疫組織化學結(jié)果總分為染色陽性細胞率計分和染色強度計分的乘積，其中總分≤1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），3～6分為中等強度陽性（++），7～9分為強陽性（+++）。由2名病理醫(yī)師鏡下閱片，復核診斷及進行組織病理學分級。

1.4 基于TCGA、GTEx數(shù)據(jù)庫分析LRP1在Pca組織中的表達

利用腫瘤基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）（https：//portal.gdc.c-ancer.gov/） 數(shù) 據(jù) 庫 下 載LRP1基因在前列腺癌和癌旁正常組織中的表達數(shù)據(jù)。共搜集545例患者信息，其中癌組織493例，癌旁正常組織 52 例。在 GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）網(wǎng)站上對TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫的LRP1基因表達數(shù)據(jù)進行整合（包括492例前列腺癌組織和152例癌旁正常組織），于GEPIA網(wǎng)站對整合后的數(shù)據(jù)進行繪圖［17］。

1.5 LRP1基因的網(wǎng)絡(luò)互作分析

通過 String網(wǎng)站（https：//string-db.org/）構(gòu)建LRP1基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI），分析其與LRP1的關(guān)聯(lián)且在KEGG通路中顯示參與前列腺癌通路的相關(guān)基因［18］，并對相關(guān)基因進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用STATA 15.1和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。Logistic回歸計算OR值和95%CI來估算SNP與前列腺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)；采用χ2檢驗分析不同組織的染色表達差異；兩組計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析；網(wǎng)絡(luò)互作分析在GEPIA網(wǎng)站中進行，采用Pearson檢驗進行相關(guān)性分析［17］。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LRP1基因SNP與Pca遺傳易感性的關(guān)系

共驗證9個候選SNP，其中外顯子測序的2個SNP未在ChinaPca數(shù)據(jù)庫中提取到數(shù)據(jù)；GWAS Catlog的7個SNP在ChinaPca數(shù)據(jù)中均提取到相關(guān)基因型數(shù)據(jù)，對這7個SNP進行分析，結(jié)果顯示rs11172113可能與前列腺癌發(fā)病有關(guān)（P=0.083），rs11172113雜合子TC基因型是Pca發(fā)病的危險因素（OR=1.267，95%CI：1.066～1.505，P=0.007），見表 2。

表2 rs11172113在ChinaPca GWAS數(shù)據(jù)中的驗證結(jié)果Tab.2 rs11172113 in ChinaPca GWAS data validation results

2.2 免疫組化檢測結(jié)果

免疫組化檢測結(jié)果顯示，前列腺癌癌組織與癌旁正常組織中LRP1的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.167）；前列腺炎與癌旁正常組織的LRP1陽性表達率差異亦無統(tǒng)計學意義（P＞0.999）。見表3。鏡下可見LRP1在癌旁正常組織中的染色程度較深，而在癌組織及前列腺炎組織染色程度較淺，見圖1。

表3 免疫組化檢測LRP1在不同前列腺組織中的表達Tab.3 Immunohistochemical analysis of LRP1 expression in different prostate tissues

圖1 免疫組化檢測LRP1在不同前列腺組織中的表達（DAB染色×200）Fig.1 Expression of LRP1 in different prostate tissues was detected by immunohistochemistry（DAB×200）

2.3 TCGA、GTEx數(shù)據(jù)庫中LRP1基因的表達

在TCGA數(shù)據(jù)庫中，LRP1在前列腺癌和癌旁組織中的表達量分別為12.105±0.904和12.150±0.786，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.729），見圖2A。進一步分析發(fā)現(xiàn)LRP1表達量與年齡、TNM分期、Gleason評分以及種族無關(guān)（P＞0.05），見表4。在GEPIA網(wǎng)站上對TCGA和GETx數(shù)據(jù)庫中LRP1基因表達量數(shù)據(jù)進行整合分析，結(jié)果顯示LRP1在前列腺癌組織中的表達量低于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖2B。

表4 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析Pca組織LRP1表達與臨床病理特征的關(guān)系Tab.4 Relationship between LRP1 level and clinical information in Pca based on TCGA database

圖2 LRP1基因在Pca癌組織和癌旁正常組織中的表達Fig.2 Expression of LRP1 gene in Pca tissues and adjacent normal tissues

2.4 LRP1蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

通過String網(wǎng)站構(gòu)建LRP1基因PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)3個基因與LRP1相互聯(lián)系且在KEGG通路分析參與前列腺癌通路，分別為組織型纖溶酶原激活物（PLAT）、血小板衍生生長因子亞基B（PDGFB）和血小板衍生生長因子受體-β（PDGFRB），見圖3。在GEPIA網(wǎng)站進行Pearson分析，結(jié)果顯示PDGFB基因、PDGFRB基因和PLAT基因表達均與LRP1基因呈正相關(guān)（r=0.74，P<0.001；r=0.40，P<0.001；r=0.093，P=0.018）。3個基因在前列腺癌癌組織中的表達量均低于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖 4。

圖3 基于String網(wǎng)站構(gòu)建LRP1蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Protein interaction network for LRP1 builted on the String website

圖4 基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫分析PLAT、PDGFB、PDGFRB基因在Pca組織和癌旁正常組織中的表達Fig.4 Expression of PLAT,PDGFB and PDGFRB genes in Pca tissues and adjacent normal tissues based on TCGA and GTEx databases

3 討論

前列腺癌的發(fā)病是一個復雜的過程，目前致病機制仍不清楚。LRP1有胞吞和傳遞信號的作用，對腫瘤微環(huán)境形成有重要作用［19］。本研究從LRP1單核苷酸多態(tài)性和LRP1基因表達量兩方面探討LRP1在前列腺癌發(fā)病中的作用。GWAS是在全基因組范圍內(nèi)找出存在的序列變異，即單核苷酸多態(tài)性（SNP），從中篩選出致病位點。ChinaPca GWAS數(shù)據(jù)庫是目前我國最大的前列腺癌全基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)表了多篇關(guān)于前列腺癌SNP研究文章［5，20］。本研究通過該數(shù)據(jù)庫驗證了7個LRP1基因的SNP，發(fā)現(xiàn)LRP1基因rs11172113的TC雜合子突變基因型是前列腺癌發(fā)病的危險因素，提示rs11172113位點可能是前列腺癌的遺傳易感位點。

本研究免疫組化檢測結(jié)果顯示，LRP1在癌旁正常組織呈中等強度陽性，而在前列腺癌癌組織呈弱陽性，與國外研究結(jié)果一致［21］，但LRP1在前列腺癌癌組織與癌旁正常組織中的表達未顯示統(tǒng)計學差異性，可能與樣本量較少有關(guān)。本研究還從TCGA數(shù)據(jù)庫中搜集了LRP1基因的表達量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果亦顯示LRP1基因在前列腺癌癌組織和癌旁正常組織中的表達量差異無統(tǒng)計學意義。因TCGA數(shù)據(jù)庫的前列腺正常組織例數(shù)較少，為排除其可能導致的統(tǒng)計學偏差，本研究在GEPIA網(wǎng)站中整合了TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示LRP1在前列腺正常組織中的表達量高于前列腺癌癌組織，與免疫組化結(jié)果一致，說明LRP1在前列腺癌癌組織中呈低表達，且可能參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。

有研究發(fā)現(xiàn)LRP1可通過激活ERK通路和抑制JNK通路而促進癌細胞侵襲［22］，ERK通路和JNK通路是參與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的重要通路［23］。本研究在String網(wǎng)站上構(gòu)建LRP1的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)LRP1與PLAT、PDGFB和PDGFRB相關(guān)，同時KEGG通路顯示3個基因均參與前列腺癌相關(guān)通路，統(tǒng)計分析結(jié)果提示LRP1表達與3個基因呈正相關(guān)，且前列腺癌癌組織和癌旁組織中3個基因的表達量差異顯著。

綜上所述，LRP1基因的rs11172113位點可能是前列腺癌的遺傳易感性位點。LRP1在前列腺癌癌組織中低表達，且可能通過調(diào)節(jié)PLAT、PDGFB和PDGFRB基因表達調(diào)控前列腺癌相關(guān)通路，從而導致前列腺癌發(fā)病。但本研究僅基于數(shù)據(jù)庫分析，其具體作用機制還需開展基礎(chǔ)實驗和臨床試驗進一步研究。