王明湖 張孝天 吳國(guó)林 蔣琪 施勇烽

（1 寧波市種植業(yè)管理總站，浙江 寧波315012；2 江西財(cái)經(jīng)大學(xué)藝術(shù)學(xué)院，南昌330013；3 中國(guó)水稻研究所，杭州310006；第一作者：8227155@qq.com）

農(nóng)作物品種和種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著《種子法》和《植物新品種保護(hù)條例》的頒布實(shí)施，我國(guó)包括水稻在內(nèi)的農(nóng)作物種子產(chǎn)業(yè)得到迅速發(fā)展，種子企業(yè)和品種數(shù)量明顯增加，但同時(shí)也存在不同程度的品種雷同、侵權(quán)等現(xiàn)象。植物新品種測(cè)試（DUS測(cè)試）可根據(jù)品種特異性、一致性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果判定品種是否屬于新品種，但由于其測(cè)試周期較長(zhǎng)、工作量大、易受環(huán)境因素影響等原因，導(dǎo)致在實(shí)踐中很難及時(shí)高效的對(duì)大量品種進(jìn)行鑒定。

研究表明，分子標(biāo)記以DNA 序列多樣性為基礎(chǔ)，能穩(wěn)定遺傳且可反映品種分子特征，具有高度的專一性和特異性，可應(yīng)用于品種真實(shí)性鑒定、純度鑒定和審定監(jiān)管等多個(gè)環(huán)節(jié)。我國(guó)已在小麥、玉米、水稻等作物品種中建立了DNA 指紋鑒定技術(shù)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，并推薦了一批可用于不同作物的核心分子標(biāo)記。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2007年頒布了《水稻品種鑒定DNA 指紋方法》（NY/T 1433-2007），并于2014年將其修訂為《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR 標(biāo)記法》（NY/T 1433-2014），在2007年的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，推薦的SSR 標(biāo)記為24 個(gè)，在2014年修訂版中標(biāo)記數(shù)增加為48 個(gè)，這顯然可大幅提高品種鑒別能力，更加適應(yīng)目前水稻品種審定監(jiān)管的要求。

寧波地處寧紹平原，為浙江省傳統(tǒng)的單雙季秈粳稻區(qū)和水稻高產(chǎn)區(qū)[1]。2010—2015年，寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的甬秈15、甬秈69、寧81、寧88 及甬優(yōu)12 等甬優(yōu)系列組合在早稻、常規(guī)晚粳稻和雜交晚粳稻中的累計(jì)種植面積遠(yuǎn)超其他品種[2]。本研究征集了部分寧波地區(qū)水稻品種，利用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦引物構(gòu)建34 個(gè)品種的指紋圖譜，分析品種間的遺傳相似性，同時(shí)利用2 個(gè)標(biāo)記對(duì)19 個(gè)甬優(yōu)系列雜交稻品種的純度進(jìn)行了鑒定，以期為水稻品種鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)在寧波地區(qū)生產(chǎn)或培育的品種鑒定應(yīng)用方面提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

34 個(gè)寧波地區(qū)水稻品種用于DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建，主要包括甬優(yōu)系列雜交稻組合、常規(guī)早稻品種、常規(guī)晚稻品種及雜交晚秈稻品種，具體為：甬優(yōu)6號(hào)、甬優(yōu)8 號(hào)、甬優(yōu)9 號(hào)、甬優(yōu)10 號(hào)、甬優(yōu)15、甬優(yōu)17、甬優(yōu)12、甬優(yōu)362、甬優(yōu)538、甬優(yōu)720、甬優(yōu)1512、甬優(yōu)1540、甬優(yōu)1640、甬優(yōu)2640、秀水134、中早39、嘉育253、嘉育280、秀水09、嘉禾218、甬秈15、甬秈69、寧81、黃華占、紹糯9714、臺(tái)糯1 號(hào)、甬糯34、揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào)、豐優(yōu)22、中浙優(yōu)1 號(hào)、秀水519、中浙優(yōu)8 號(hào)、中浙優(yōu)10 號(hào)、寧88。

表1 53 個(gè)SSR 標(biāo)記的基本信息

19 個(gè)甬優(yōu)秈粳雜交品種（甬優(yōu)9 號(hào)、甬優(yōu)10 號(hào)、甬優(yōu)15、甬優(yōu)17、甬優(yōu)12、甬優(yōu)538、甬優(yōu)1540、甬優(yōu)2640、甬優(yōu)7861、甬優(yōu)1538、甬優(yōu)4149、甬優(yōu)4949、甬優(yōu)59、甬優(yōu)58、甬優(yōu)35、甬優(yōu)51、甬優(yōu)31、甬優(yōu)55、甬優(yōu)50）用于純度鑒定。

1.2 DNA 提取

采用簡(jiǎn)易法提取水稻總DNA，用于數(shù)據(jù)構(gòu)建的品種每份提取3 個(gè)單株，用于純度鑒定的品種每份隨機(jī)提取100 個(gè)單株。提取的DNA 溶解于50 μL 的1xTE中，儲(chǔ)存于-20℃溫度下。

1.3 SSR 標(biāo)記及PCR

采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1433-2007 和NY/T1433-2014 推薦的SSR 引物（表1）作為品種鑒定標(biāo)記，引物由上海生工合成。

PCR 反應(yīng)總體積10 μL，包含1 μL 的模板DNA、1.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、正反向引物各0.5 μmol/L、5xSSR buffer 2 μL 和Taq DNA 聚合酶0.5U。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在Biometra T-Grandient PCR 儀中進(jìn)行。

1.4 電泳檢測(cè)

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-24B 型電泳儀，用6.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離和銀染顯色。電泳緩沖液為1XTBE，電泳電壓120V，銀染顯色后記錄帶型。

1.5 數(shù)據(jù)分析

SSR 標(biāo)記多態(tài)性信息含量（PIC）按照公式PICi=1-其中Pij表示標(biāo)記i 的第j 個(gè)等位基因在樣本中的分布頻率，n 為標(biāo)記i 總等位基因數(shù)，PIC 值用于反應(yīng)標(biāo)記在樣本中檢測(cè)的多態(tài)性值。同時(shí)，應(yīng)用軟件NTSYS，以similarity 方法計(jì)算相似系數(shù)并進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 標(biāo)記的多態(tài)性

53 對(duì)引物在34 份研究材料中共檢測(cè)到183 個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物獲得的等位基因數(shù)為3.5 個(gè)，每個(gè)SSR 標(biāo)記可以檢測(cè)到的等位基因數(shù)為1～7 個(gè)，有49個(gè)標(biāo)記的PIC 在0.3 以上，其中37 個(gè)在0.5 以上（表1）。引物RM176 僅檢測(cè)到1 個(gè)等位基因數(shù)，引物RM72、RM219、RM297 則檢測(cè)到7 個(gè)等位基因數(shù)。根據(jù)NY/T-1433-2014 推薦引物的分組，發(fā)現(xiàn)I 組平均獲得的等位基因數(shù)為4.3 個(gè)，II 組為3.2 個(gè)，III 組為3.3 個(gè)，IV 組為2.8 個(gè)。將NY/T-1433-2007 中推薦但NY/T-1433-2014 淘汰的5 個(gè)標(biāo)記歸為V 組，其平均獲得的等位基因數(shù)為4.2 個(gè)。

表2 利用I 組SSR 標(biāo)記構(gòu)建的34 個(gè)品種DNA 指紋圖譜

2.2 DNA 指紋圖譜的建立

以53 個(gè)標(biāo)記建立34 份研究材料的DNA 指紋圖譜，表2 為12 個(gè)I 組標(biāo)記獲得的34 份材料DNA 指紋圖譜。每列數(shù)據(jù)代表某SSR 標(biāo)記在34 份材料中檢測(cè)的帶型的數(shù)字化代號(hào)，如11 表示檢測(cè)出純合1 的等位基因型，22 表示檢測(cè)出純合2 的等位基因型，而12 則表示檢測(cè)到包含1 和2 的雜合等位基因型，未檢測(cè)到任一等位基因型則記為00。這些數(shù)字化代號(hào)按同樣的順序排列起來(lái)就構(gòu)成了這34 份水稻品種的分子身份證號(hào)碼，如甬優(yōu)6 號(hào)的I 組分子身份證號(hào)碼為441512111111124633112211。筆者發(fā)現(xiàn)，用I 組標(biāo)記獲得的甬優(yōu)15 和甬優(yōu)17 分子身份證號(hào)碼完全相同，這也表明甬優(yōu)15 和甬優(yōu)17 的親緣關(guān)系非常近，僅用12個(gè)I 組標(biāo)記無(wú)法鑒定兩者的差異，但增加NY/T1433-2014 推薦的另外36 個(gè)標(biāo)記后，則可將甬優(yōu)15 和甬優(yōu)17 區(qū)分開。

2.3 聚類分析

應(yīng)用53 對(duì)SSR 引物檢測(cè)34 份供試材料，其遺傳相似性系數(shù)的變化范圍為0.13～0.97，平均相似系數(shù)為0.50?；诰垲惙治觯⒁粋€(gè)系統(tǒng)樹（圖1），相似系數(shù)閾值設(shè)為0.50 時(shí)，可將上述材料分為2 個(gè)類群。類群GI 屬于偏粳稻類型，包括14 個(gè)甬優(yōu)系列秈粳雜交稻品種、6 個(gè)常規(guī)粳稻品種和3 個(gè)糯稻品種，類群GII 則屬于秈稻類型，其中包括6 個(gè)常規(guī)秈稻品種和5 個(gè)雜交秈稻品種。設(shè)相似系數(shù)閾值為0.71，又可將類群GI分為GI-I、GI-II 和GI-III 3 個(gè)亞群。GI-I 亞群包括甬優(yōu)6 號(hào)、甬優(yōu)8 號(hào)、甬優(yōu)9 號(hào)、甬優(yōu)1512、甬優(yōu)12、甬優(yōu)15、甬優(yōu)17、甬優(yōu)538、甬優(yōu)1640、甬優(yōu)1540 和甬優(yōu)2640。GI-II 亞群包括甬優(yōu)10 號(hào)、甬優(yōu)362 和甬優(yōu)720。GI-III 亞群則包括常規(guī)粳稻嘉禾218、秀水09、秀水134、秀水519、寧81、寧88 和臺(tái)糯1 號(hào)、甬糯34、紹糯9714 等3 個(gè)糯稻品種。設(shè)相似閾值為0.59，可將類群GII 分為GII-I 和GII-II 亞群。GII-I 亞群包括常規(guī)秈稻品種中早39、嘉育253、嘉育280、甬秈15 和甬秈69，而GII-II 則包括常規(guī)秈稻黃華占和雜交秈稻揚(yáng)兩優(yōu)6 號(hào)、豐優(yōu)22、中浙優(yōu)1 號(hào)、中浙優(yōu)8 號(hào)、中浙優(yōu)10號(hào)。

圖1 34 個(gè)品種的SSR 分子聚類圖

圖2 引物RM590 檢測(cè)100 粒甬優(yōu)50 的結(jié)果

2.4 品種純度分析

引物RM590 在甬優(yōu)10 號(hào)中僅擴(kuò)增出1 個(gè)等位基因，其余18 個(gè)品種中均擴(kuò)增出父母本的2 個(gè)等位基因，而RM3331 在甬優(yōu)9 號(hào)、甬優(yōu)1540、甬優(yōu)2640 等9 個(gè)品種中擴(kuò)增出父母本的2 個(gè)等位基因。利用引物RM590 和RM3331 分別對(duì)19 個(gè)甬優(yōu)系列雜交稻組合進(jìn)行純度分析。結(jié)果表明，100 粒隨機(jī)抽取的樣品中，甬優(yōu)50 和甬優(yōu)2640 在2 個(gè)標(biāo)記中均檢測(cè)到1 個(gè)相同單株的混雜，圖2 為甬優(yōu)50 的100 個(gè)隨機(jī)單株用RM590 標(biāo)記檢測(cè)的電泳結(jié)果。其余17 個(gè)品種均未檢測(cè)到混雜單株。

3 討論

目前SSR 標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于水稻品種數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建。程本義等[3]對(duì)2002—2006年浙江省98 個(gè)主要的水稻品種及2007—2008年155 個(gè)浙江省區(qū)試品種進(jìn)行了DNA 指紋檢測(cè)，應(yīng)用12 個(gè)SSR 標(biāo)記構(gòu)建了279 個(gè)次水稻品種DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。馬紅勃等[4]用2007 版行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的24 個(gè)SSR 標(biāo)記分析了福建省24 份雜交稻品種和18份雜交稻親本的遺傳多樣性，并建立了42 份材料×12個(gè)標(biāo)記的指紋圖譜。另外，有研究者也利用SSR 標(biāo)記分析了品種的遺傳多樣性，如羅兵等[5]應(yīng)用24 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)太湖稻區(qū)現(xiàn)代粳稻品種的遺傳背景進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域種植的粳稻品種背景相似性高，多樣性不夠豐富。

本研究利用SSR 標(biāo)記對(duì)34 份寧波地區(qū)水稻品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，53 個(gè)SSR 標(biāo)記共檢測(cè)到183個(gè)等位基因，每個(gè)標(biāo)記可檢測(cè)出的等位基因的范圍是1～7 個(gè)，平均每個(gè)SSR 標(biāo)記獲得3.5 個(gè)等位基因，明顯低于云南陸稻品種的平均等位基因數(shù)（8.125）[6]，也低于太湖地區(qū)粳稻品種的平均等位基因數(shù)（4.57）[5]，稍高于廣西和廣東優(yōu)質(zhì)常規(guī)稻的平均等位基因數(shù)及黑龍江主栽品種的平均等位基因數(shù)[7-8]，這可能與選用的SSR標(biāo)記及實(shí)驗(yàn)材料的差異有關(guān)。

左示敏等[9]利用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T-1433-2007 和NY/T-1433-2014 中分別推薦的24 個(gè)和48 個(gè)標(biāo)記均不能完全將46 份江蘇粳稻相互鑒別開，這既表明江蘇粳稻品種間的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，也說(shuō)明現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)并不能完全適用于江蘇粳稻特異性鑒定。林亦霞等[10]在利用標(biāo)準(zhǔn)推薦引物建立94 份雜交稻親本的數(shù)字分子指紋庫(kù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)RM176 和RM551 的多態(tài)性不高。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，RM176 等部分推薦標(biāo)記的多態(tài)性不高，對(duì)測(cè)試品種的鑒別力較弱，在后續(xù)的應(yīng)用中需要進(jìn)一步篩選一些多態(tài)性高的SSR 標(biāo)記，以提高SSR 標(biāo)記對(duì)水稻品種的鑒別力。