董嬌 張霓霓 姚禮 張立剛 王明雪 王帥 黃桂林

舍格倫綜合癥、頭頸部惡性腫瘤放射治療常常導(dǎo)致涎腺分泌功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。組織工程學(xué)方法再生涎腺能重建腺泡、導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，恢復(fù)涎腺受損的分泌功能，是目前較有前景的治療方法［2］。生物材料［3-4］作為其重要組成部分，成為目前的研究熱點。人工合成材料因為缺少生物活性成分，多為“惰性”界面，不能取得良好的再生效果。相比而言，天然組織來源的細(xì)胞外基質(zhì)是優(yōu)良的組織工程支架材料。涎腺和肝臟同屬于外分泌腺體，而且在胚層發(fā)育上同屬于外胚層來源，具有胚層來源相關(guān)性［5］，肝臟ECM亦是理想的組織工程天然支架來源。肝素-透明質(zhì)酸水凝膠是廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域的一種支架載體，具有緩釋生長因子［6］、具有生物活性、促進(jìn)三維培養(yǎng)［7］等諸多優(yōu)點。大量研究表明，用改良方法制備的肝素-透明質(zhì)酸-肝臟細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠（HP-HA-肝ECM水凝膠）有利于組織再生［8］；但是該HP-HA-肝ECM水凝膠在涎腺再生中的作用尚未見報道。目前，組織工程化涎腺類器官研究存在的問題是：缺少具有生物活性成分、具有緩釋作用的生物支架材料，因而不能為組織工程化涎腺類器官三維培養(yǎng)提供良好微環(huán)境。所以，本研究希望采用與之類似的改良方法制作一種HP-HA-肝ECM水凝膠，尋找到一種具有生物活性、能緩釋生長因子、能夠自組裝和三維培養(yǎng)的生物支架材料，為后續(xù)三維構(gòu)建組織工程化涎腺類器官的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物來源8周齡20只雌、雄性SD大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供，雌鼠平均體重250 g，雄鼠平均體重300 g，動物許可證號：SCXK（渝）2012-0005，成年雌雄性大鼠交配后生產(chǎn)，按醫(yī)學(xué)倫理學(xué)中對動物處置的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相關(guān)操作。

1.2 試劑和儀器

DMEM／F12（SH30023.01B，Hyclone，美國）；胎牛血清 （16000-044，Gibco，美國）；表皮生長因子（E5036）、胰島素（91077C）、氫化可的松（614157）、轉(zhuǎn)化生長因子、胃蛋白酶（P6887）（T9580，Sigma，美國）；CK7抗鼠單克隆抗體（Aab181598）、α-淀粉酶抗鼠多克隆抗體（ab125230）、Alexa Fluor?488熒光二抗（ab150077，Abcam，英國）；臺式凍干機(jī)（VirTis，Bench-TopPro，美國），NuncTMLab-TekTMChamber Slide System（177445PK）、酶聯(lián)免疫檢測（1500，Thermo，美國）。

1.3 制備HP-HA-肝ECM水凝膠

無菌條件下切取健康大鼠肝臟，PBS液洗凈血液，-80℃冰凍保存48 h。復(fù)溫解凍，挑選質(zhì)地勻稱的部位，剪成1 cm3小塊后用500 ml ddH2O，200 r／min震蕩沖洗3 d，每天更換液體3次。再用2%TritonX-100沖洗4 d，每天更換2次液體。最后用ddH2O沖洗2 d，4℃冰箱保存。用HE染色及DAPI染色法鑒定大鼠肝臟ECM脫細(xì)胞的效果。凍干處理肝ECM 48 h后，冰凍球磨儀研磨，100 mg肝臟ECM粉末用1%胃蛋白酶溶液消化溶解48 h，3 000 r／min離心15 min，反復(fù)離心3次至上清液清澈，將得到的膠狀混合物（即肝ECM成分）用0.22μm過濾器過濾，紫外線消毒，4℃保存。在室溫下用雙蒸水完全溶解Heprasil、Gelin-S、Extralink粉末形成2%、2%、4%溶液，2 h內(nèi)以2∶2∶1比例充分混合，加入1／10比例的膠狀肝ECM成分，充分混勻，30 min內(nèi)完全成為凝膠狀態(tài)。

1.4 下頜下腺細(xì)胞培養(yǎng)及分組

處死新生1 d的SD大鼠后，無菌條件下切取其下頜下腺腺體組織并保留部分導(dǎo)管，PBS液清洗，剝離周圍纖維組織；將腺體剪切成3 mm3小塊，PBS液清洗，以50塊／瓶接種到用1%明膠包被的T25培養(yǎng)瓶，5%CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)4 h，待組織塊完全貼壁后，再加入2 ml完全培養(yǎng)基；3 d后，查看組織塊四周有無細(xì)胞爬出并貼壁，每2 d換液1次，控制胰酶消化時間法去除成纖維細(xì)胞，至貼壁達(dá)80%時以1∶2的比例傳代，取第2代細(xì)胞用于后續(xù)步驟的檢測。下頜下腺細(xì)胞接種于HP-HA-肝ECM水凝膠上為實驗組，直接培養(yǎng)于96孔板或48孔板中為對照組。

1.5 免疫學(xué)方法鑒定α-淀粉酶及CK7的表達(dá)

免疫熒光化學(xué)方法鑒定α-淀粉酶的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定CK7表達(dá)。以PBS液為陰性對照組。熒光顯微鏡及倒置相差顯微鏡保留影像學(xué)資料。

1.6 細(xì)胞毒性試驗

包被組將100μl第2代大鼠下頜下腺細(xì)胞懸液滴加至包被膠表面并孵育4 h（37℃，5%CO2），待細(xì)胞貼壁后，用PBS液輕輕沖洗3次，洗去未貼壁及死亡的細(xì)胞，然后再次在每孔中加入HP-HA-肝ECM水凝膠，室溫下交聯(lián)1 h，在每孔中加入100μl完全培養(yǎng)基覆蓋膠體表面，置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。不包被組為對照組，細(xì)胞直接接種于96孔板中。每組設(shè)置5個平行孔，分別在培養(yǎng)的第1、3、5、7天時每孔加入20μl的CCK-8溶液，孵育4 h后，于酶標(biāo)儀上測定A＝490 nm時每孔的吸光度值，記錄并比較。

1.7 細(xì)胞活力實驗

同上述方法進(jìn)行48孔板的包被、細(xì)胞的消化、接種、分組及培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、3、5、7天，利用Live／Dead細(xì)胞染色法評估細(xì)胞存活情況。簡述如下：等量的活、死細(xì)胞染色試劑均勻混合獲得2×的Live／Dead染色母液，PBS液1∶1比例稀釋獲得Live／Dead工作液，吸棄原培養(yǎng)基，PBS液沖洗1次，加入染色劑后于室溫下孵育15 min，因為膠體較厚，實驗組孵育時間可延長至45 min。于熒光顯微鏡下拍照并比較。共重復(fù)3次。每次每組設(shè)置3個培養(yǎng)孔，拍照時每個培養(yǎng)孔以同樣放大倍數(shù)隨機(jī)選取3個不同視野分別拍照。計算死細(xì)胞比率。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肝臟ECM的HE及DAPI染色

脫細(xì)胞處理前，HE切片中細(xì)胞核藍(lán)紫色、形態(tài)圓潤，DAPI染色中可見亮藍(lán)色細(xì)胞核，表明肝臟脫細(xì)胞處理前組織內(nèi)有大量細(xì)胞。脫細(xì)胞處理后，HE及DAPI染色中細(xì)胞核消失，表明肝臟脫細(xì)胞處理后細(xì)胞脫除完全（圖1）。

2.2 大鼠肝ECM成分的獲取及交聯(lián)獲得HP-HA-肝ECM水凝膠

圖1 肝臟脫細(xì)胞前后的比較 （×100）Fig 1 Comparison of the liver tissue before and after decellularization （×100）

經(jīng)過脫細(xì)胞化、凍干、冰凍研磨、胃蛋白酶溶解后得到的膠狀肝ECM成分（圖2A）。該成分外觀通透，無肉眼可見雜質(zhì)，無明顯異味（圖2B）。成品肝素-透明質(zhì)酸水凝膠，初始為均質(zhì)白色固態(tài)，待完全溶解后為透明狀液體。將兩者交聯(lián)得到HP-HA-肝ECM水凝膠，無色無味透明狀，稍黏稠，30 min完全成為凝膠狀態(tài)（圖2C），分別包被于96孔板和48孔板中（圖2D～E）。

2.3 新生SD大鼠下頜下腺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

原代培養(yǎng)第3天可見典型的上皮細(xì)胞貼壁，第4天時可見少量成纖維細(xì)胞，采用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞后可得到形態(tài)較為一致的下頜下腺細(xì)胞，第5天時于顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈多角形，邊界清晰，排列呈鵝卵石樣外觀；培養(yǎng)至第14天時，可見細(xì)胞排列緊密，呈鋪路石狀，胞漿豐富，可見分泌顆粒（圖3）。培養(yǎng)第14天時第1次傳代。

圖2 肝ECM成分的獲取及交聯(lián)Fig 2 The preparation of liver decellularized extracellular matrix and crosslink

圖3 原代培養(yǎng)的SD大鼠下頜下腺細(xì)胞形態(tài)（A：×200；B：×400）Fig 3 Primaryly cultured submandibular gland cells of SD rat（A：×200；B：×400）

2.4 體外培養(yǎng)SD大鼠下頜下腺細(xì)胞免疫學(xué)鑒定

以α-淀粉酶和CK7作為下頜下腺細(xì)胞的標(biāo)記蛋白。α-淀粉酶和CK7陽性表達(dá)的表現(xiàn)是下頜下腺細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)呈綠色熒光染色和棕色染色。α-淀粉酶免疫熒光染色和CK7免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果PBS液作為陰性對照。第2代SD大鼠下頜下腺細(xì)胞陽性表達(dá)α-淀粉酶、CK7標(biāo)記蛋白。對照組結(jié)果陰性（圖4）。

圖4 SD大鼠下頜下腺細(xì)胞α-淀粉酶和CK7免疫學(xué)鑒定（×400）Fig 4 Immunological identification ofα-amylase and CK7 in SMGCs （×400）

2.5 下頜下腺細(xì)胞在HP-HA-肝ECM水凝膠中的增殖情況

隨時間延長，實驗組和對照組下頜下腺細(xì)胞的增殖活性均先增加后降低。實驗組在全部檢測時間段內(nèi)的細(xì)胞增殖活性高于對照組（P＜0.05）。第5天，實驗組細(xì)胞增殖活性高于對照組（P＜0.05）（圖5）。

2.6 下頜下腺細(xì)胞在HP-HA-肝ECM水凝膠中的存活情況

死細(xì)胞比率指某一具體時間點死亡細(xì)胞數(shù)目占細(xì)胞總數(shù)目的百分比。圖6示實驗組和對照組下頜下腺細(xì)胞在培養(yǎng)第1、3、5、7天時的存活情況。經(jīng)Live／Dead細(xì)胞染色法染色后，異硫氰酸熒光素染色活細(xì)胞，表現(xiàn)為綠色熒光，德克薩斯紅染色死細(xì)胞，表現(xiàn)為紅色熒光。隨時間延長，實驗組和對照組活細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，相同檢測時間點時，實驗組活細(xì)胞數(shù)目多于對照組。統(tǒng)計死細(xì)胞比率如圖7。在1～7 d內(nèi)，HPHA-肝ECM水凝膠組的死細(xì)胞比率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。第5天和第7天時，實驗組死細(xì)胞比率較對照組降低（P＜0.05）。

圖5 細(xì)胞的生長曲線Fig 5 The cell growth curves

圖6 下頜下腺細(xì)胞在HP-HA-肝ECM水凝膠材料上的存活情況 （Live／Dead細(xì)胞染色法，×100）Fig 6 The survival of SMGCs cultured on the HP-HA-liver ECM-hydrogel（Live／Dead Cell Imaging，×100）

圖7 2組細(xì)胞的死細(xì)胞比率Fig 7 The cell death ratio of the 2 groups

3 討 論

脫細(xì)胞方法是獲得組織工程學(xué)再造器官天然生物支架的一種重要方法，發(fā)揮著不可替代的作用。目前，采用物理、化學(xué)和生物制劑等脫細(xì)胞技術(shù)制取的生物支架已廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域，但是不同脫細(xì)胞方法對ECM的結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞外基質(zhì)本身含有的生長因子及蛋白保存的影響卻不一樣。本研究的脫細(xì)胞方法采用了對ECM成分、結(jié)構(gòu)影響較小的冷凍復(fù)融法［9-11］、TritonX-100［12］和胃蛋白酶［13］，避免了SDS［14］等其他方法破壞ECM結(jié)構(gòu)、溶解ECM成分。大量ddH2O輔助沖洗、低溫的設(shè)置、抗生素的使用等均有利于在保留肝臟原有ECM結(jié)構(gòu)及蛋白成分的同時去除細(xì)胞成分。用HE染色及DAPI染色鑒定脫細(xì)胞效果，HE及DAPI染色圖均表明：處理前肝組織內(nèi)含有大量細(xì)胞，但脫細(xì)胞處理后細(xì)胞脫除完全，為后期HP-HA-肝ECM水凝膠的制備奠定了基礎(chǔ)。

本研究后續(xù)步驟采用凍干、冰凍球磨儀低溫研磨、胃蛋白酶溶解消化、高速離心方法獲得凝膠狀肝ECM成分。相比于肝臟ECM粉末，該凝膠狀態(tài)肝ECM更能充分融合并交聯(lián)肝素-透明質(zhì)酸水凝膠，從而有利于充分發(fā)揮2種膠體材料的優(yōu)勢。有研究發(fā)現(xiàn)，肝素的緩釋作用［15-16］和透明質(zhì)酸水凝膠的載體效應(yīng)［17-18］在理論上均應(yīng)有利于該ECM水凝膠材料激活脫細(xì)胞化肝臟ECM中的生長因子和蛋白基質(zhì)成分并發(fā)揮其營養(yǎng)作用［7，19］。

通過分析改良脫細(xì)胞方法和肝素透明質(zhì)酸水凝膠作用后，認(rèn)為HP-HA-肝ECM水凝膠作為三維構(gòu)建組織工程化涎腺類器官的支架材料具備較多優(yōu)越性。生物相容性［20］是生物材料研究中始終貫穿的主題。細(xì)胞相容性是其中的一個方面，它是指宿主細(xì)胞對生物材料產(chǎn)生反應(yīng)的一種性能。細(xì)胞相容性一般要求材料應(yīng)該具有細(xì)胞黏附性、細(xì)胞激活性和抗炎癥性、無誘變性、無抗原性、無致癌性、無抑制細(xì)胞生長性、無致畸性等等。目前檢測細(xì)胞相容性的研究方法有：過敏實驗、細(xì)胞毒性實驗、顯性致死實驗、植入實驗（皮下植入實驗、骨內(nèi)植入實驗）、遺傳毒性和致癌實驗等等。本實驗中CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力，考察的是支架材料是否會抑制細(xì)胞生長、有無細(xì)胞毒性；Live／Dead細(xì)胞染色法檢測了細(xì)胞的存活情況，考察的是生長于支架材料上的細(xì)胞的存活情況。CCK-8結(jié)果中，下頜下腺細(xì)胞接種于HP-HA-肝ECM水凝膠后，在全部檢測時間段內(nèi)的細(xì)胞增殖活性高于對照組（P＜0.05），表明HP-HA-肝ECM水凝膠有助于提高細(xì)胞增殖活性。Live／Dead細(xì)胞染色法結(jié)果中，下頜下腺細(xì)胞接種于HP-HA-肝ECM水凝膠后，在全部檢測時間段內(nèi)死細(xì)胞比率低于對照組（P＜0.05），表明HP-HA-肝ECM水凝膠有助于降低死細(xì)胞比率。以上2個實驗結(jié)果均表明：HP-HA-肝ECM水凝膠有助于下頜下腺細(xì)胞的存活并提高其增殖活性，降低死細(xì)胞比率。這表明HP-HA-肝ECM水凝膠材料具有細(xì)胞相容性。所以綜上所述，自制的HP-HA-肝ECM水凝膠具有細(xì)胞相容性，為涎腺類器官的構(gòu)建提供了理想的支架材料。

有研究表明Triton X-100灌注法制備大鼠肝臟ECM支架比SDS灌注法更能保留GAGs和膠原成分，體內(nèi)植入后亦有更好的膠原纖維重塑反應(yīng)［21］；王雷等用細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原蛋白免疫熒光染色和苦味酸-天狼星紅染色證實，大鼠肝臟灌注Triton X-100能在完全脫除細(xì)胞的同時有效保留肝臟ECM中的膠原成分［22-23］。所以，下一步本研究將對自制的HP-HA-肝ECM水凝膠中含有的生物活性因子及蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，如對細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、GAGs和彈性蛋白進(jìn)行定量或半定量分析，比較肝臟脫細(xì)胞前、后ECM中生物活性成分含量的變化。另外，本研究將對該ECM水凝膠體三維構(gòu)建組織工程化涎腺類器官的可能性及能力進(jìn)行評估。希望獲得細(xì)胞相容性良好、具有生物活性、有利于種子細(xì)胞自組裝和三維培養(yǎng)的理想細(xì)胞外基質(zhì)支架材料，為組織工程化涎腺類器官三維構(gòu)建的研究打下基礎(chǔ)。