賴穎真 周麟 陳江

牙種植體穿過牙齦的上皮和結(jié)締組織到達(dá)骨內(nèi)，形成了2個(gè)界面：種植體骨組織界面，種植體軟組織界面。其中種植體軟組織愈合良好有利于形成良好的邊緣封閉及阻止細(xì)菌入侵的作用。研究發(fā)現(xiàn)口腔黏膜的上皮細(xì)胞具有沿著種植體根方遷移的趨勢(shì)，良好的結(jié)締組織愈合有利于阻止上皮的根方遷移［1］，課題組研究［2］發(fā)現(xiàn)種植體穿齦部分的微溝槽結(jié)構(gòu)有利于引導(dǎo)結(jié)締組織的牙齦成纖維細(xì)胞順著溝槽生長(zhǎng)緊束牙齦結(jié)締組織，然而溝槽結(jié)構(gòu)一定程度上增加了材料的表面積，從一定程度上增加了細(xì)菌黏附的可能，如何在微溝槽上面制作合適的納米抗菌涂層是本研究的重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)銀（Ag）具有良好的抗菌性能，但影響細(xì)胞的生物相容性，氮化鈦涂層的細(xì)胞生物相容性較好，但抗菌性能略差［2］，本研究利用2種涂層的優(yōu)缺點(diǎn)，在60 μm寬，10μm深的溝槽結(jié)構(gòu)表面，利用磁控濺射技術(shù)制作5%Ag的TiN／Ag的納米復(fù)合膜（TiN／Ag-MG），研究新的材料表面對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞生物活性及牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）抗菌性能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備及理化性能檢測(cè)

60μm寬，10μm深的微溝槽表面硅片制作方法同課題先前［3］，JS-3X-100B磁控濺射臺(tái)，掃描電鏡（FE-SEM）（LEO1530，Zeiss，德國(guó)），原子力顯微鏡（AFM）（Agilent，5500，美國(guó)），親水性測(cè)量?jī)x（KRUSS DSA30），X射線光電子能譜儀（XPS）（Thermo Scientific ESCALAB 250，美國(guó)），電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）（DRC-e，PE公司，美國(guó)）。

利用磁控濺射臺(tái)，對(duì)照組選擇（Ti靶），濺射200 nm鈦，實(shí)驗(yàn)組選擇Ti靶+Ag靶，濺射氣體為高純度氮?dú)?，通過調(diào)節(jié)Ag靶功率條件Ag含量為5%。材料面積為2 cm×2 cm。

掃描電鏡放大倍數(shù)500倍觀察材料表面微溝槽形貌，原子力顯微鏡（測(cè)量范圍2μm×2μm），觀察涂層表面納米形貌，測(cè)量納米級(jí)粗糙度。利用XPS分析各種涂層表面（測(cè)量范圍2 mm×3 mm）的元素含量?jī)r(jià)態(tài)與結(jié)合方式。利用ICP-MS測(cè)量TiN／Ag-MG材料表面Ag+離子釋放：將材料浸泡在10 ml純水中，測(cè)量1、3、5、7 d的Ag+釋放量。每次測(cè)量完后更換新的純水，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量3次。材料的底面積為1 cm2最終濃度換算為ppb。

1.2 牙齦成纖維細(xì)胞培養(yǎng)和材料對(duì)生物活性檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)：DMEM低糖培養(yǎng)液（Gibco，美國(guó)），胎牛血清FBS（HyClon，美國(guó)）；細(xì)胞活性檢測(cè)：吖啶橙／碘化丙啶（AO／PI）染色；免疫熒光：一抗：Monoclonal Anti-Vinculin antibody（V9131，Sigma），二抗：Anti-Mouse IgG（whole molecule）-FITC antibody（F0257，Sigma），細(xì)胞骨架：羅丹明鬼筆環(huán)肽Rhodamine Phalloidin（Cat.＃PHDR1，Cytoskeleton），細(xì)胞核DAPI（D9542，Sigma）；細(xì)胞周期：細(xì)胞周期試劑盒（南京凱基），流式細(xì)胞儀（FC-500，貝克曼庫(kù)爾特，美國(guó)）。

AO-PI染色：牙齦成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)同前［3］，AO-PI染色：HGF接種于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料1 d，放入24孔板，每孔加入500μl AO／PI，室溫避光15 min，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)HGF細(xì)胞中活細(xì)胞個(gè)數(shù)，重復(fù)7次，并計(jì)算百分比。

細(xì)胞周期：材料（2 cm×2 cm）消毒后放入6孔板，接種HGF 1×105個(gè)／孔，培養(yǎng)1、3、7 d，消化細(xì)胞，加ACCUTASETM細(xì)胞消化液，吹打分離材料片上的細(xì)胞收集至離心管，加入預(yù)冷70%乙醇，4℃固定1 h；離心收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀中加入RNaseA重懸，37℃水浴30 min；再加入400μl PI染色，4℃避光30 min；用300目尼龍網(wǎng)（孔徑40～50μm）過濾細(xì)胞，去除細(xì)胞團(tuán)塊；1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量分布，Modfit 2.0軟件分析。

免疫熒光：材料（1 cm×1 cm）消毒后放置于24孔板中，接種HGF 3.5×104個(gè)／孔，培養(yǎng)1 d，4%多聚甲醛室溫固定15 min，，0.5%Triton X-100室溫破膜5 min，1%BSA室溫封閉30 min；一抗：anti-vinculin antibody，37℃孵育1 h；二抗：Anti-Mouse IgG（whole molecule）-FITC 1∶32，37℃避光30 min；細(xì)胞骨架Rhodamine Phalloidin，300μl／孔，37℃避光30 min，PBS清洗1次；DAPI染色：室溫避光作用3～5 min；將材料片倒扣在滴有抗淬滅封片劑的蓋玻片，熒光倒置顯微鏡100倍拍照觀察。

1.3 材料對(duì)Pg抗菌性能檢測(cè)

Pg ATCC 33277，LIVE／DEAD?BacLightTMBacterial Viability Kits（L7007 Invitrogen），BHI 3.7 g／100 ml，YEA 0.5 g／100 ml，Hemin 1 ml／100 ml，Vitk3 0.2 ml／100 ml，厭氧產(chǎn)氣袋AnaeroPackTM-Anaero（C-11）。

材料（1 cm×1 cm）常規(guī)消毒后放置于24孔板中，A值為0.01菌液濃度接種于24孔板，在厭氧環(huán)境中培養(yǎng)1 d，加入STYO9／PI熒光染料避光15 min，將材料倒扣在蓋玻片于倒置熒光顯微鏡下100倍觀察拍照，重復(fù)7次，用Image J（http：／／rsb.info.nih.gov／ij／）進(jìn)行熒光像素定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析，組間統(tǒng)計(jì)SNK-q test進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 材料表面理化性能檢測(cè)

掃描電鏡結(jié)果（圖1）顯示對(duì)照組表面形貌為光滑，實(shí)驗(yàn)組為規(guī)則的溝槽結(jié)構(gòu)，溝槽寬度為60μm，深度為10μm。原子力顯微鏡結(jié)果（圖2）顯示Ti涂層納米顆粒較大，納米粗糙度為：1.9 nm，TiN／Ag涂層納米顆粒較小，納米粗糙度為1.45 nm，實(shí)驗(yàn)組表面的納米粗糙度小于對(duì)照組（圖3）。親水性結(jié)果顯示對(duì)照組接觸角99°，實(shí)驗(yàn)組接觸角42°，實(shí)驗(yàn)組材料表面的親水性優(yōu)于對(duì)照組。表面元素含量分析顯示：TiN／Ag-MG表面含有3.54%間隙氮（N），同時(shí)存在Ag 3 d，對(duì)照組材料表面不存在間隙氮（N），無Ag 3 d，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表面O 1s含量接近。實(shí)驗(yàn)組TiN／Ag-MG材料Ag釋放量在第1天最高，后逐漸下降，到第3天后趨于穩(wěn)態(tài)（圖4）。

圖1 材料表面微米級(jí)形貌（SEM）Fig 1 Microtopography of material surfaces（SEM）

圖2 材料表面納米級(jí)形貌（AFM）Fig 2 Nanotopography of material surfaces（AFM）

圖3 材料表面靜態(tài)接觸角Fig 3 Static contact angle of different material surfaces

圖4 TiN／Ag-MG材料Ag+釋放量Fig 4 Silver ion release of TiN／Ag-MG

2.2 材料表面死活細(xì)胞檢測(cè)

根據(jù)AO／PI原理，活細(xì)胞核呈亮綠色熒光，而死細(xì)胞核呈現(xiàn)橙紅色（圖5）。選擇1 d Ag+釋放量最大的時(shí)間點(diǎn)，可見各組細(xì)胞中死細(xì)胞和活細(xì)胞比例沒有明顯差異，經(jīng)過計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組組活細(xì)胞比例分別為：90.5%，91.5%，P＞0.05，差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以推測(cè)實(shí)驗(yàn)組5%Ag的TiN／Ag的納米復(fù)合膜中Ag+釋放量沒有加重HGF細(xì)胞的凋亡。

圖5 HGFs在材料表面（AO／PI染色）Fig 5 HGFs on the material surfaces（AO／PI staining）

2.3 材料表面細(xì)胞周期推進(jìn)

紅色區(qū)域代表細(xì)胞增殖期S（圖6），可見實(shí)驗(yàn)組材料表面紅色區(qū)域面積明顯大于對(duì)照組，即在HGF培養(yǎng)第1、3、7天，實(shí)驗(yàn)組材料表面細(xì)胞增殖周期推進(jìn)比例均大于對(duì)照組，可見微溝槽表面加5%Ag的TiN／Ag的納米復(fù)合膜有利于促進(jìn)HGF的增殖。

2.4 HGF在材料表面的免疫熒光染色

細(xì)胞在材料表面免疫熒光（圖7）：藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核，綠色熒光代表細(xì)胞Vinculin蛋白，紅色熒光代表細(xì)胞骨架，可見對(duì)照組表面HGFs無規(guī)律排列，實(shí)驗(yàn)組材料表面HGFs順著溝槽有規(guī)律排列，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組表面生長(zhǎng)細(xì)胞多于對(duì)照組。

2.5 Pg在材料表面死活菌黏附檢測(cè)

圖8綠色熒光代表活菌，橙色代表死菌，對(duì)照組材料表面綠色熒光即活菌的密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組，幾乎連成片狀菌斑，實(shí)驗(yàn)組材料表面綠色熒光代表的活菌黏附量明顯少于對(duì)照組，且細(xì)菌狀態(tài)不佳，出現(xiàn)較多黃色或橙色熒光，實(shí)驗(yàn)組材料顯示了較好的抗菌性能。

3 討 論

種植體穿齦部分與周圍組織愈合的好壞關(guān)系到種植體的邊緣封閉性能，該部分與組織愈合的越牢固，越能防止口腔內(nèi)細(xì)菌順著種植體邊緣垂直遷移入深部，導(dǎo)致種植體周圍炎和種植體失敗。本課題組先期致力于加強(qiáng)種植體邊緣愈合而進(jìn)行種植體穿齦部分的微溝槽改性，研究證明微溝槽的存在確實(shí)有利于周圍HGFs的生物活性，由于微溝槽的存在一定程度下增加了細(xì)菌可以黏附的表面積，需要在溝槽表面制作一定的抗菌涂層，研究證明Ag涂層具有良好的抗菌性能［4］，然而先期研究做了單獨(dú)的Ag涂層和TiN涂層，研究發(fā)現(xiàn)Ag涂層抗菌性能好，但對(duì)HGFs的生物活性影響較大［5］，TiN抗菌性能一般，但對(duì)HGFs的生物活性較優(yōu)［6］。因此本實(shí)驗(yàn)利用2種涂層的性能，對(duì)磁控濺射工藝進(jìn)行改良，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)制作5%Ag的TiN／Ag的納米復(fù)合膜于微溝槽（MG，寬度60μm，深度10μm）表面，稱為TiN／Ag-MG。

圖6 HGFs在材料表面細(xì)胞周期圖Fig 6 Cell cycle diagram of HGFs on material surfaces

圖7 HGFs在材料表面免疫熒光染色Fig 7 Immunofluorescence stained of HGFs on material surfaces

圖8 Pg在材料表面的死活菌檢測(cè)Fig 8 Detection of dead／live Pg on the material surfaces

3.1 TiN／Ag-MG對(duì)HGFs生物活性的影響

結(jié)果顯示：TiN／Ag-MG材料表面死細(xì)胞的量沒有高于對(duì)照組，同時(shí)細(xì)胞周期S期所占的比例高于對(duì)照組，細(xì)胞骨架排列良好，順著溝槽方向排列。可見新的復(fù)合涂層材料表面有利于HGF的生物活性，保持了溝槽具有的“接觸誘導(dǎo)效應(yīng)”。分析其原因與材料本身的理化性質(zhì)有關(guān)，研究認(rèn)為［7］材料表面的納米粗糙度越小，越有利與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的推進(jìn)，復(fù)合涂層材料表面納米顆粒小于對(duì)照組，納米粗糙度也小于對(duì)照組，有利于HGF在材料表面細(xì)胞周期的推進(jìn)和細(xì)胞的增殖。此外，研究還發(fā)現(xiàn)［7］材料疏水性越大，細(xì)胞在材料表面黏附鋪展的越差，細(xì)胞骨架呈皺縮狀態(tài)，材料表面親水性越好，越有利于細(xì)胞黏附，細(xì)胞骨架的鋪展越好，實(shí)驗(yàn)組材料由于溝槽形貌存在，N元素的加入［5］，材料的親水性優(yōu)于對(duì)照組，接觸角為42°，HGF在其表面黏附狀態(tài)優(yōu)于光滑對(duì)照組，細(xì)胞骨架順著溝槽表面鋪展，顯示出良好的細(xì)胞黏附狀態(tài)。最后，5%Ag含量所帶來的Ag離子釋放量較低，沒有導(dǎo)致明顯的細(xì)胞死亡，這在AO-PI實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，少量Ag涂層的存在沒有影響細(xì)胞的生物活性，分析原因可能是由于Ag含量較低，且TiN涂層3.54%間隙氮（N）有利于細(xì)胞的生物活性，兩者綜合的結(jié)果還是有利于HGF的生物活性。

3.2 TiN／Ag-MG對(duì)Pg抗菌性能的影響

材料表面微溝槽形貌的改變一定程度上增加了材料的表面積，有研究認(rèn)為微溝槽形貌的存在形成了保護(hù)細(xì)菌的場(chǎng)所，免受周圍液體的沖刷［8］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)合納米涂層材料表面細(xì)菌黏附的量遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)組，可見溝槽的存在雖然增加了細(xì)菌黏附的表面積，但其他的理化性能彌補(bǔ)了這一不足。首先細(xì)菌黏附在材料表面主要依靠材料與細(xì)菌的疏水作用力。材料表面疏水性越大，細(xì)菌黏附的越多越牢，微溝槽的形貌的存在極大降低了材料的疏水性，因此實(shí)驗(yàn)組材料表面的親水性不利于細(xì)菌的黏附，其次，材料表面的納米粗糙度對(duì)細(xì)菌黏附的影響不同的研究有不同觀點(diǎn)，有研究認(rèn)為細(xì)菌的黏附與納米粗糙度的大小無關(guān)，也有研究認(rèn)為納米粗糙度增加能刺激細(xì)菌新陳代謝，促進(jìn)細(xì)菌繁殖，相反的也有研究認(rèn)為納米粗糙度增加能減少細(xì)菌的黏附［9］，與傳統(tǒng)觀點(diǎn)越光滑的表面細(xì)菌黏附越少相反，本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組納米粗糙度較小，實(shí)際細(xì)菌黏附減少，可能還有與復(fù)合涂層中Ag離子的釋放關(guān)系很大，Ag離子一開始能夠抑制細(xì)菌的黏附，進(jìn)而直接影響細(xì)菌的分裂增殖，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂而死亡，本實(shí)驗(yàn)ICP測(cè)試復(fù)合抗菌膜上方Ag離子釋放從第1天到第7天始終高于1 ppb，研究證明0.1 ppb就能達(dá)到較好的抗菌作用［10］，因此微溝槽上方復(fù)合涂層的抗菌效果應(yīng)該來源于材料表面的親水性及Ag離子的釋放。

綜上所述，具有5%Ag的TiN／Ag復(fù)合抗菌涂層與微溝槽形貌結(jié)合（TiN／Ag-MG）材料優(yōu)于單一Ag或TiN涂層，有利于牙齦成纖維細(xì)胞粘附增殖及細(xì)胞周期推進(jìn)，并能引導(dǎo)細(xì)胞順著溝槽生長(zhǎng)，同時(shí)具有良好的抗菌性能，可以運(yùn)用于種植體穿齦部分表面。