徐梅 牛玉明 梁守建 陳德森

慢性牙周炎約占牙周炎患者的95%，是由長(zhǎng)期存 在的牙齦炎向深部牙周組織擴(kuò)展而引起的最常見的一類牙周炎，其主要的病理改變?yōu)檠乐艽脱啦酃俏眨?］。牙周致病菌滋生是導(dǎo)致牙齦炎的主要病因，而牙齦炎可逐漸、隱匿地過(guò)渡成牙周炎，導(dǎo)致牙齒與牙齦分離，嚴(yán)重者造成牙齒松動(dòng)甚至脫落，降低了患者生活質(zhì)量，嚴(yán)重威脅患者口腔健康，且近年來(lái)其發(fā)病率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)［2］。因此，提高患者生活質(zhì)量，早期發(fā)現(xiàn)和診斷，防止牙槽骨吸收十分重要。治療慢性牙周炎的關(guān)鍵是促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞活性，抑制牙周膜細(xì)胞炎癥因子釋放。牙周膜細(xì)胞即能合成膠原、亦可降解膠原，能夠不斷分化成成骨細(xì)胞而形成新的主纖維和牙骨質(zhì)，對(duì)牙槽骨改建、創(chuàng)傷修復(fù)和牙周再生中發(fā)揮重要作用，牙周膜細(xì)胞是牙周組織中的主要功能細(xì)胞［3］。故在對(duì)慢性牙周炎治療中，除應(yīng)用抗生素、治療牙周袋、修復(fù)遭到破壞的牙槽骨外，還應(yīng)注重牙周膜細(xì)胞的再生功能。大黃素是從掌葉大黃的根莖中提取的生物堿，具有抗炎、抗腫瘤、抗微生物生長(zhǎng)、免疫抑制等作用，目前已有研究證實(shí)其可通過(guò)抑制炎癥因子而治療牙周炎［4］。但大黃素是否對(duì)牙周膜細(xì)胞的再生功能產(chǎn)生影響卻鮮有報(bào)道，本研究采用牙周結(jié)扎并在牙齦涂布卟啉單胞菌混懸液的方法建立大鼠慢性牙周炎模型，觀察大黃素牙周膜細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，為尋找治療慢性牙周炎潛在的有效藥物提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和分組

SPF級(jí)SD大鼠30只，雌雄不拘，體質(zhì)量180～200 g，動(dòng)物購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，所進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)符合倫理學(xué)原則，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則，給予SD大鼠人道關(guān)懷。本實(shí)驗(yàn)在湖北省隨州市中心醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物使用合格證編號(hào)：SCXK（京）2017-019；實(shí)驗(yàn)室設(shè)施合格證編號(hào)：［SYXK（鄂）2018-001］。實(shí)驗(yàn)時(shí)選取其中20只正常健康大鼠構(gòu)建慢性牙周炎模型并隨機(jī)均分為模型組和大黃素組（n＝10），另10只正常健康大鼠不造模，設(shè)為對(duì)照組。

1.2 主要藥品及試劑

大黃素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：B10249，上海士鋒生物科技有限公司）；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ）和牙齦組織核因子 κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：H0347和0315，上海超研生物科技有限公司）；牙周膜組織中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：4361、4325和4327，上海信裕生物科技有限公司）；流式細(xì)胞儀（貝克曼庫(kù)爾特中國(guó)分公司，美國(guó)）；酶聯(lián)檢測(cè)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠慢性牙周炎模型的建立 模型建立采用牙周結(jié)扎后手術(shù)區(qū)域牙齦涂布卟啉單胞菌混懸液的方法。在牙周結(jié)扎手術(shù)前，大鼠禁食1 d，不禁水。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射（0.25 ml／kg）全麻大鼠，于上頜第一、二磨牙牙周行8字交叉結(jié)扎，術(shù)后1周后開始在手術(shù)區(qū)域牙齦涂布卟啉單胞菌混懸液，間隔2 d涂藥1次，共涂菌15～20次（約8～10周）至第一、二磨牙牙間隙增寬、牙根分叉暴露，牙槽出現(xiàn)嚴(yán)重骨吸收為牙周炎模型建模成功標(biāo)準(zhǔn)［5］。然后拆除第一、二磨牙結(jié)扎絲，開始進(jìn)行藥物治療實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 治療 治療前先將大黃素配制成0.5%的溶液，根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥換算公式計(jì)算大鼠大黃素的用藥劑量。大黃素組的用藥劑量為每日2 ml／kg，采用灌胃給予大黃素的方法治療，模型組和對(duì)照組正常飼養(yǎng)，每鼠灌胃給予0.9%生理鹽水（2 ml／kg）對(duì)照。所有動(dòng)物均按上述灌服給藥方法治療2周。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)牙周膜細(xì)胞周期 處死大鼠后摘取上頜第一、二磨牙，小心刮取牙周組織制成組織勻漿，常規(guī)胰酶消化法收集勻漿懸液牙周膜細(xì)胞細(xì)胞，用500μl Buffer A（5 g／LBSA，100 mml／L PBS）重懸，洗滌2次，加300μl細(xì)胞染色液（含RNase A 50μg／ml，PI 25μg／ml）吹勻，4℃避光溫孵30 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)牙周膜細(xì)胞周期，用Cell Quest析軟件分析各組G1／G0、G2／M、S、G2+S細(xì)胞所占百分率。

1.3.4 Western blotting檢測(cè)牙周膜組織PPAR-γ和NF-κB表達(dá) 取上述牙周組織制成組織勻漿，3 000 r／min離心10 min，取上清，-80℃冰箱凍存?zhèn)錅y(cè)。按試劑盒說(shuō)明書操作，先提取總蛋白，經(jīng)SDS分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜；加入兔抗人PPAR-γ和NF-κB抗體，用封閉緩沖液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫1 h，振搖，4℃過(guò)夜。TBST室溫洗膜2次，每次10 min；加二抗，在鏈霉親和素-偶聯(lián)物即鏈霉親和素-POD中孵育；在大容量的TBST中洗膜4次，每次15 min；在DAB中室溫孵育5～15 min；設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450 nm，讀取樣品A值，使用Curve expert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算PPAR-γ和NF-κB濃度。

1.3.5 ELISA檢測(cè)牙周膜細(xì)胞IL-6、IL-8和IL-1β濃度 取上述牙周組織制成組織勻漿，離心（3 000 r／min）10 min，取上清，-80℃冰箱凍存?zhèn)錅y(cè)。離心管中加稀釋標(biāo)準(zhǔn)、輕輕振蕩使之充分混勻。設(shè)96孔，每孔準(zhǔn)確加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品，室溫下孵育2 h。準(zhǔn)確加入100μl用Assay Dliuent稀釋的備測(cè)樣本。加一抗后吸出標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，加入300μl 1×wash buffer，振蕩、沖洗3次。加入100μl detection antibody solution。密封孔板后于室溫下孵育2 h。然后加鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶的生物素標(biāo)記過(guò)夜，吸出Detection antibody solution，洗板，加100μl稀釋的streptavidin-HRP solution室溫下孵育，30 min后吸出streptavidin-HRPsolution，然后洗板4次。加100μl底物室溫避光孵育30 min至變色，迅速加入終止液100μl，30 min后移至Bio-Rad酶標(biāo)儀，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置為540 nm，讀取樣本吸光度A值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出IL-6、IL-8和IL-1β的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大黃素對(duì)大鼠牙周膜細(xì)胞周期的影響

FCM檢測(cè)顯示模型組牙周膜細(xì)胞G1／G0和G2／M較對(duì)照組明顯升高，而S和G2+S明顯降低（P＜0.05），提示模型組大鼠牙周膜細(xì)胞增殖放緩，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞增殖在S期和G2期分化增殖受阻。大黃素組牙周膜細(xì)胞G1／G0和G2／M較模型組明顯降低，而S和G2+S明顯升高（P＜0.05），與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示大黃素治療，大鼠牙周膜細(xì)胞細(xì)胞活力增強(qiáng)，S期和G2期分化增殖速度增快（表1）。

表1 各組大鼠牙周膜細(xì)胞周期分布比較 （n＝10，%，）Tab 1 Comparison of periodontal ligament cell cycle distribution of the rats among groups（n＝10，%，）

表1 各組大鼠牙周膜細(xì)胞周期分布比較 （n＝10，%，）Tab 1 Comparison of periodontal ligament cell cycle distribution of the rats among groups（n＝10，%，）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

+S對(duì)照組組 別 G1／G0 G2／M S G2 56.02±7.82 7.02±0.91 34.17±8.02 45.14±6.47模 型 組 75.19±8.06① 9.15±1.04① 14.84±1.63① 22.96±2.03①大黃素組 57.24±6.43② 6.87±0.81② 35.17±7.51② 43.64±5.86②

2.2 大黃素對(duì)大鼠牙周組織PPAR-γ和NF-κB表達(dá)的影響

Western blotting檢測(cè)檢測(cè)顯示模型組牙周組織且PPAR-γ表達(dá)降低、而NF-κB表達(dá)增強(qiáng)，與對(duì)照組比較（P＜0.05）；而大黃素組牙周組織PPAR-γ高表達(dá)、而NF-κB低表達(dá)（P＜0.05）（表2）。

2.3 大黃素對(duì)大鼠牙周組織IL-6、IL-8和IL-1β濃度的影響

與對(duì)照組比較，模型組牙周組織IL-6、IL-8和IL-1β濃度升高（P＜0.05）；而大黃素組IL-6、IL-8和IL-1β濃度降低（P＜0.05），與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 各組大鼠牙周組織PPAR-γ和NF-κB表達(dá)比較及IL-6、IL-8和IL-1β濃度比較（n＝10，pg／ml，）Tab 2 Comparison of PPAR-γgamma and NF-κB expression and IL-6，IL-8 and IL-1βconcentrations in periodontal tissues of the rats among the groups （n＝10，pg／ml，）

表2 各組大鼠牙周組織PPAR-γ和NF-κB表達(dá)比較及IL-6、IL-8和IL-1β濃度比較（n＝10，pg／ml，）Tab 2 Comparison of PPAR-γgamma and NF-κB expression and IL-6，IL-8 and IL-1βconcentrations in periodontal tissues of the rats among the groups （n＝10，pg／ml，）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

組 別 PPAR-γ NF-κB IL-6 IL-1βIL-8對(duì) 照 組 19.57±2.04 27.35±3.14 0.27±0.02 0.43±0.06 0.12±0.03模 型 組 11.31±1.68① 41.33±5.27① 1.38±0.37① 1.53±0.22① 0.72±0.09①大黃素組 20.13±3.29② 26.54±2.97② 0.26±0.07② 0.42±0.09② 0.13±0.02②

3 討 論

慢性牙周炎一類嚴(yán)重威脅類口腔健康的牙周病，因牙周炎可導(dǎo)致牙齒與牙齦分離造成牙齒松動(dòng)甚至脫落而影響進(jìn)食，是造成患者營(yíng)養(yǎng)不良的重要病因，對(duì)其治療的關(guān)鍵是促進(jìn)患者牙周膜細(xì)胞增殖、使牙周組織再生，形成牙周新附著，因此，如何使牙周膜細(xì)胞快速增殖和分化并有效的附著在根面是治療的關(guān)鍵所在［6-7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞快速增殖和分化，增強(qiáng)牙周膜細(xì)胞活力，表現(xiàn)在G1／G0和G2／M較模型組明顯降低，而S和G2+S明顯升高。牙周膜細(xì)胞的增殖是通過(guò)細(xì)胞周期來(lái)實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞開始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞為止所經(jīng)歷的過(guò)程。整個(gè)細(xì)胞周期分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和M期（細(xì)胞分裂期）4個(gè)階段。其中S和G2+S是DNA合成的關(guān)鍵時(shí)期，處于此階段的細(xì)胞增殖旺盛，其比例在細(xì)胞周期中較高［8］。因此，S和G2+S在細(xì)胞周期中可客觀地反映細(xì)胞增殖能力和活力［9］。有研究表明，大黃素可通過(guò)抑制內(nèi)毒素而促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖［10］。但目前沒有實(shí)驗(yàn)證實(shí)其是否是通過(guò)影響S和G2+S期而增強(qiáng)牙周膜細(xì)胞增殖能力和活力。本實(shí)驗(yàn)觀察到：大黃素組S和G2+S分別為（35.17±7.51）%和（43.64±5.86）%，明顯高于模型組的（14.84±1.63）%和（22.96±2.03）%，這一結(jié)果提示經(jīng)大黃素治療，大鼠牙周膜細(xì)胞細(xì)胞活力增強(qiáng)，S期和G2期分化增殖速度增快。

本研究還發(fā)現(xiàn)，大黃素組牙周組織PPAR-γ高表達(dá)、而NF-κB低表達(dá)，IL-6、IL-8和IL-1β濃度較模型組明顯降低。研究表明，牙周炎患者體內(nèi)NF-κB長(zhǎng)期處于高激活狀態(tài)，而NF-κB又可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-1β的產(chǎn)生，造成骨與牙周組織破壞增強(qiáng)，故抑制NF-κB活性可減少炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-1β的產(chǎn)生，降低后者對(duì)骨與牙周組織的破壞［11］。大黃素可能作用于NF-κB信號(hào)通路，抑制NF-κB活性，間接減少炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IL-1β的產(chǎn)生而發(fā)揮保護(hù)牙周組織炎癥創(chuàng)面的作用［12］。PPAR-γ是核激素受體家族中的配體激活受體，PPAR-γ與配體結(jié)合后調(diào)節(jié)多種核內(nèi)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與程序性細(xì)胞死亡及細(xì)胞分化的發(fā)生發(fā)展［13］。PPAR-γ還可通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路而實(shí)驗(yàn)現(xiàn)抑制炎性細(xì)胞因子（如IL-6、IL-8和IL-1β）的產(chǎn)生，提高PPAR-γ表達(dá)能顯著抑制炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)，這對(duì)牙周炎的治療具有重要意義［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大黃素具有上調(diào)PPAR-γ表達(dá)的作用，降低NF-κB表達(dá)，并通過(guò)降低NF-κB表達(dá)而抑制子IL-6、IL-8和IL-1β的產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用。

總之，大黃素可能通過(guò)促進(jìn)大鼠牙周膜細(xì)胞S期和G2期分化和增殖速度，增加細(xì)胞活性，并通過(guò)提高PPAR-γ信號(hào)通路下調(diào)NF-κB表達(dá)，進(jìn)而抑制牙周膜細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8和IL-1β的表達(dá)而降低牙周組織炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)慢性牙周炎的治療作用。本實(shí)驗(yàn)的重要發(fā)現(xiàn)是觀察到大黃素可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的再生功能，這對(duì)臨床治療慢性牙周炎具有后果要意義，為治療慢性牙周炎提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。