楊偉紅 黃生高 于樂(lè)蓉

牙根吸收是正畸治療常見(jiàn)并發(fā)癥之一，其生物學(xué)機(jī)制與骨吸收類(lèi)似，是一種多細(xì)胞／多因子共同參與、協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜過(guò)程［1］。破牙骨質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)和功能上類(lèi)似于破骨細(xì)胞，在牙根吸收中發(fā)揮破牙骨質(zhì)作用，溶解無(wú)機(jī)礦物質(zhì)、降解細(xì)胞外有機(jī)基質(zhì)［2］。核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是促進(jìn)破骨細(xì)胞和破牙骨質(zhì)細(xì)胞分化和激活的重要因子，RANKL與破牙骨質(zhì)細(xì)胞前體表面的特異性受體RANK結(jié)合進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)破牙骨質(zhì)細(xì)胞的形成和分化［3］；TNF-α可直接或間接地促進(jìn)破牙骨質(zhì)細(xì)胞分化和增殖［4］。

牙周炎是一種漸進(jìn)性感染性的炎性疾病，可導(dǎo)致牙槽骨吸收和牙周附著喪失。在細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物刺激下牙周韌帶成纖維細(xì)胞表達(dá)的RANKL和TNF-α增加［5］，與成纖維細(xì)胞在機(jī)械力作用下的反應(yīng)類(lèi)似［6］。實(shí)驗(yàn)觀察伴或不伴有牙周炎大鼠正畸牙的壓力側(cè)牙根吸收情況、破牙骨質(zhì)細(xì)胞數(shù)目以及RANKL和TNF-α的表達(dá)，探究牙周炎對(duì)正畸性牙根吸收的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗RANKL抗體（23408-1-AP）、小鼠抗TNF-α抗體（60291-1-Ig，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；TRAP試劑盒（自配）；SP免疫組化試劑盒（PV9001）、DAB顯色盒（ZLI-9018，北京中山金橋）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及牙周炎模型建立

40只6周齡雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量（250±10）g，由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。隨機(jī)分為牙周炎組和對(duì)照組，每組20只。牙周炎組依據(jù)Nakamura-Kiyama等［7］的方法，使用3-0絲線(xiàn)結(jié)扎于大鼠左側(cè)上頜第一磨牙牙頸部；對(duì)照組不作絲線(xiàn)結(jié)扎。正常飲食飼養(yǎng)4周后2組各處死5只作為加力0 d組。

1.3 大鼠正畸牙移動(dòng)

將大鼠上頜切牙作為支抗，使用鎳鈦拉簧提供持續(xù)牽引力（0.49 N）近中移動(dòng)上頜第一磨牙，建立牙周炎組和對(duì)照組正畸牙移動(dòng)模型，加力3、7、14 d后2組各處死5只。

1.4 組織學(xué)標(biāo)本制備

取上頜標(biāo)本常規(guī)固定、脫鈣、脫水、石蠟包埋，沿第一磨牙近遠(yuǎn)中方向連續(xù)切片，厚度為4μm。常規(guī)HE染色、按照試劑盒上的說(shuō)明分別進(jìn)行TRAP染色、RANKL和TNF-α免疫組化染色。

1.5 圖像處理

每個(gè)標(biāo)本取5張切片，Winceph 8.0軟件測(cè)量上頜第一磨牙遠(yuǎn)頰根牙根吸收面積和牙根總面積，計(jì)算牙根吸收指數(shù)（牙根吸收指數(shù)＝牙根吸收面積／牙根總面積）。TRAP和IHC染色的切片于遠(yuǎn)頰根壓力側(cè)牙根表面隨機(jī)選取3個(gè)不重疊視野（×400）進(jìn)行圖像采集。TRAP陽(yáng)性染色、胞核在2個(gè)或以上且位于牙根表面的細(xì)胞計(jì)數(shù)為多核破牙骨質(zhì)細(xì)胞，其余為單核破牙骨質(zhì)細(xì)胞。IHC切片采用Image Pro Plus圖像分析軟件測(cè)量RANKL、TNF-α平均光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS23.0軟件統(tǒng)計(jì)，非參數(shù)檢驗(yàn)法分析牙根吸收指數(shù)；計(jì)量資料以表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 牙周及牙根吸收情況

加力0 d時(shí)進(jìn)行牙周檢查，牙周炎組：牙齦紅腫，探診出血，探及牙周袋；對(duì)照組：牙周情況良好。X線(xiàn)片：與對(duì)照組相比，牙周炎組牙槽骨低平，釉質(zhì)牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂距離增加，根分叉暴露（圖1）。

加力3 d時(shí)牙根表面罕見(jiàn)吸收跡象，7 d時(shí)可見(jiàn)大量牙根吸收陷窩，14 d時(shí)牙根吸收面積增加，未見(jiàn)有吸收陷窩修復(fù)的表現(xiàn)（圖2）。加力7、14 d時(shí)牙周炎組牙根吸收指數(shù)顯著大于對(duì)照組（P＜0.05）（圖3）。

圖1 加力0 d大鼠正畸牙X線(xiàn)片檢查Fig 1 X-ray examination of orthodontic teeth in rats at day 0

圖2 2組大鼠牙根吸收的變化 （×100）Fig 2 The changes of root absorption of the rats in the 2 groups （×100）

圖3 加壓后不同時(shí)間2組大鼠牙根吸收Fig 3 Rat root absorption of the 2 groups after loading

2.2 破牙骨質(zhì)細(xì)胞數(shù)目變化

加力后破牙骨質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)在壓力側(cè)牙根表面，主要分布于牙根吸收陷窩周?chē)▓D4）。單核破牙骨質(zhì)細(xì)胞在加力3 d時(shí)最多，而多核破牙骨質(zhì)細(xì)胞在加力7 d時(shí)最多，加力7 d時(shí)牙周炎組單核和多核破牙骨質(zhì)細(xì)胞數(shù)目均高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖5）。

2.3 RANKL、TNF-α的表達(dá)

RANKL在加力7 d時(shí)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖6），加力3、7、14 d時(shí)牙周炎組明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。TNF-α在加力7 d時(shí)陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)（圖7），加力3、7、14 d時(shí)牙周炎組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（表1）。

圖4 TRAP染色（×400）Fig 4 TRAP stained （×400）

圖5 加力后不同時(shí)間2組大鼠破牙骨質(zhì)細(xì)胞數(shù)目Fig 5 Rat odontoclasts number of the groups after loading

表1 不同時(shí)間牙周炎組和對(duì)照組壓力側(cè)RANKL和TNF-α平均吸光度值 （，n＝5）Tab 1 A value of RANKL and TNF-αexpression at the compressive side of the groups after loading（，n＝5）

表1 不同時(shí)間牙周炎組和對(duì)照組壓力側(cè)RANKL和TNF-α平均吸光度值 （，n＝5）Tab 1 A value of RANKL and TNF-αexpression at the compressive side of the groups after loading（，n＝5）

時(shí)間RANKL TNF-α對(duì)照組 牙周炎組 P值 對(duì)照組 牙周炎組 P值5 0.085±0.005 0.541 3 d 0.095±0.004 0.162±0.001 0.009 0.143±0.001 0.215±0.003 0.002 7 d 0.244±0.003 0.313±0.005 0.036 0.313±0.004 0.511±0.006 0.000 14 d 0.051±0.002 0.109±0.004 0.022 0.085±0.0 0 d 0.059±0.002 0.050±0.001 0.484 0.063±0.00 06 0.200±0.008 0.033

圖6 2組大鼠牙周帶中RANKL的表達(dá) （×400）Fig 6 RANKL expression in periodontal ligament of rats of the 2 groups （×400）

圖7 2組大鼠牙周帶中TNF-α的表達(dá) （×400）Fig 7 TNF-αexpression in periodontal ligament of rats of the 2 groups （×400）

3 討 論

正畸力作用下牙齒張力側(cè)新骨形成、壓力側(cè)發(fā)生骨吸收，從而產(chǎn)生牙移動(dòng)。牙根吸收是正畸治療過(guò)程中一種不希望出現(xiàn)的情況，在壓力側(cè)牙根附近透明樣變清除過(guò)程中，覆蓋在牙根表面的成牙骨質(zhì)細(xì)胞層被破壞，從而使下方高度礦化的牙骨質(zhì)暴露［8］。除單核巨噬細(xì)胞外，無(wú)皺褶緣的多核TRAP陽(yáng)性巨細(xì)胞也參與透明樣變的清除，這可能是早期尚未成熟的前破骨／破牙骨質(zhì)細(xì)胞，機(jī)械力刺激下它們很快分化為成熟的破骨／破牙骨質(zhì)細(xì)胞［9］，分別參與牙槽骨和牙根吸收過(guò)程。TRAP染色可用于標(biāo)記分化后期的單核破牙骨質(zhì)細(xì)胞和成熟多核破牙骨質(zhì)細(xì)胞，能反應(yīng)牙根吸收的狀態(tài)。

骨吸收和鈣代謝主要通過(guò)RANK-RANKL-OPG軸進(jìn)行調(diào)控，在正畸牙移動(dòng)過(guò)程中該系統(tǒng)不僅調(diào)節(jié)牙槽骨的吸收改建，還對(duì)正畸性牙根吸收有重要的調(diào)控作用。Yamaguchi等［10］發(fā)現(xiàn)，發(fā)生嚴(yán)重牙根吸收的正畸牙壓力側(cè)牙周膜中RANKL表達(dá)上調(diào)；Low等［11］報(bào)道了在正畸力作用下發(fā)生牙根吸收的組織中檢測(cè)到RANKL的mRNA。本實(shí)驗(yàn)中也觀察到RANKL在牙根吸收陷窩附近的組織中高表達(dá)。

TNF-α是一種超強(qiáng)炎性介質(zhì)，能夠激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和增殖。TNF-α主要通過(guò)與TNF-R1作用發(fā)揮生物活性，Zhang等［12］發(fā)現(xiàn)敲除TNF-α的受體TNFR1可顯著抑制RANK表達(dá)，減少破骨細(xì)胞分化，從而間接影響破骨細(xì)胞形成。此外，TNF-α還可以直接刺激破骨細(xì)胞形成，在Kudo等［13］的研究中，TNF-α直接作用于前破骨細(xì)胞，誘導(dǎo)成熟多核破骨細(xì)胞形成，此過(guò)程不被骨保護(hù)素（OPG）抑制。由于破牙骨質(zhì)細(xì)胞和破骨細(xì)胞都來(lái)源于造血細(xì)胞，二者形態(tài)功能相似，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推知，TNF-α可能誘導(dǎo)破牙骨質(zhì)細(xì)胞的形成。

牙周炎是口腔兩大類(lèi)主要疾病之一，牙槽骨破壞是其最主要的診斷特征。牙周炎的病理改變不僅與牙周致病微生物及其毒性產(chǎn)物侵入有關(guān) ，還與機(jī)體防御應(yīng)答所產(chǎn)生的一系列因子有關(guān) ，如TNF-α［14］。TNF-α作為細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成員，具有廣泛的生物學(xué)作用：作為始動(dòng)因子啟動(dòng)炎癥反應(yīng)；增加破骨細(xì)胞的形成和活性，促進(jìn)骨吸收；增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生，導(dǎo)致膠原纖維破壞；刺激基質(zhì)細(xì)胞凋亡，限制牙周組織修復(fù)等［15］。牙周炎中細(xì)菌產(chǎn)生的LPS使成骨細(xì)胞RANKL表達(dá)增強(qiáng)，活化的T細(xì)胞也可分泌大量RANKL［16］。Boas等［17］發(fā)現(xiàn)正畸力作用下牙周炎大鼠的牙周組織中TNF-α表達(dá)增加，Romer等［18］的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)牙周病原體和正畸力的協(xié)同作用可刺激牙周韌帶細(xì)胞表達(dá)的RANKL上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中也觀察到RANKL和TNF-α在牙周炎組的表達(dá)高于對(duì)照組。不僅如此，牙周炎組的單核和多核破牙骨質(zhì)細(xì)胞數(shù)目加力7天時(shí)明顯多于對(duì)照組，牙根吸收也更為嚴(yán)重，這可能是由于牙周炎使RANKL、TNF-α表達(dá)增加，而這些細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)了破牙骨質(zhì)細(xì)胞的形成和活化，從而加重了牙根吸收這一正畸副反應(yīng)。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合其他學(xué)者的相關(guān)研究，提示控制牙周炎癥有利于減少正畸性牙根吸收等不良反應(yīng)的發(fā)生。