鄭 飛，張學(xué)婭，俸一然，饒宇東，許東云，張 穎

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明 650032)

現(xiàn)代社會(huì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)合并抑郁癥的患者比例逐年增加[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，住院的CHD患者有17%～27%合并有抑郁癥[2]，CHD合并抑郁癥的患者心腦血管疾病死亡率較一般CHD患者增加1.6倍[3]。這契合了胡大一教授“雙心醫(yī)學(xué)”中提出的“雙心”患者狀況[4]，因此同時(shí)治療CHD和抑郁癥具有重要意義。

中醫(yī)“腦心同治”理論指出，對(duì)于相同病因病機(jī)的心腦疾病宜選用相同的治療方藥，可取得同樣的療效。本課題認(rèn)為，抑郁癥(郁證)和CHD(胸痹)的中醫(yī)共同病機(jī)為氣滯血瘀。冠心II號(hào)(guanxin II，GXII)作為活血化瘀療法的代表方藥，除具備CHD治療作用外[5]，可能具備抗抑郁作用。本實(shí)驗(yàn)以GXII為研究工具，通過慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)聯(lián)合孤養(yǎng)方法和高脂飲食誘導(dǎo)大鼠抑郁高脂模型，探討GXII除具備治療CHD作用外，是否具備抗抑郁樣作用及其可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

Wistar雄性SPF級(jí)大鼠98只，體質(zhì)量(180～220)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(許可證號(hào)SCXK(湘)2013-0004)，飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部動(dòng)物房。

1.2 藥物及飼料

鹽酸氟西汀，Patheon France 公司(禮來蘇州制藥有限公司分裝，批號(hào)0713B)；維生素D3注射液，上海通用藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)121113)；GXII湯劑，中藥材由昆明市中醫(yī)院中藥房提供，昆明市中醫(yī)院中藥制劑室制備，生藥濃度1.0 g/ml。高脂大鼠飼料按3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料的比例制備，北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑

RIPA裂解液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)P0013B)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)P0012S)；ECL顯色液，Millipore公司(貨號(hào)WBKLS0500)；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)抗體，Abmart公司(貨號(hào)AB108319)；HRP標(biāo)記通用型二抗，Abmart公司(CST公司分裝，貨號(hào)7074S)；β-actin抗體，Proteintech公司(貨號(hào)20536-1-AP)。

1.4 儀器

SMART3.0動(dòng)物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)，Panlab公司；Any-maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)，Stoelting公司。低溫離心機(jī)，Hitachi公司(型號(hào)CF-16RX)；紫外可見分光光度計(jì)，Hitachi公司(型號(hào)U-3010)；酶標(biāo)儀，Molecular公司(型號(hào)PECTRA MAX190)；凝膠成像儀，BIO-RAD公司(型號(hào)Chemical xps+)；HE全自動(dòng)染色機(jī)，MICROM公司(型號(hào)HMS760X)；顯微鏡，Olympus Corporation公司(型號(hào)BX43)；顯微照相機(jī)，Canon公司(型號(hào)EOS600D)。

2 方法

2.1 分組

大鼠實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始分組實(shí)驗(yàn)，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為7組各14只，分別為抑郁氟西汀組(depress fuxio DF組)、抑郁GXII組、抑郁模型組、抑郁高脂氟西汀組、抑郁高脂GXII組、抑郁高脂模型組和空白對(duì)照組。

2.2 動(dòng)物模型建立

抑郁氟西汀組、抑郁GXII組和抑郁模型組：大鼠CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)方法造模，給予正常飲食；抑郁高脂氟西汀組、抑郁高脂GXII組和抑郁高脂模型組：大鼠CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)方法造模，同時(shí)給予高脂飲食，并在給予高脂飼料前一次性腹腔注射維生素D3注射液(60萬IU/kg)；空白對(duì)照組：無特殊處理，給予正常飲食，各組造模均連續(xù)8周。

2.3 給藥方法

抑郁氟西汀組、抑郁高脂氟西汀組給予鹽酸氟西汀(3.5 mg/kg)混懸液灌胃，抑郁GXII組、抑郁高脂GXII組給予GXII(2.5 g/kg)中藥湯劑灌胃，抑郁模型組、抑郁高脂模型組、空白對(duì)照組給予生理鹽水(2.5 g/kg)灌胃，各組給藥均連續(xù)15 d。

2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

測(cè)定時(shí)間為大鼠末次給藥24 h后，采用SMART3.0動(dòng)物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)。敞箱為方形100×100×40 cm大小，由木板制成，內(nèi)壁及底面均為黑色。將單只大鼠放于清潔敞箱內(nèi)，記錄5 min內(nèi)大鼠活動(dòng)總距離。每天每只大鼠僅測(cè)量1次，1只大鼠測(cè)量后待徹底清潔敞箱后再進(jìn)行下只大鼠測(cè)量。每只大鼠連續(xù)測(cè)量7 d，取最后3 d均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

測(cè)定時(shí)間為大鼠末次給藥24 h后，采用Any-maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)。水箱為圓形100×50 cm大小，由塑料制成，內(nèi)壁及底面均為黑色。將單只大鼠放于20 cm水深的水箱內(nèi)，使其后肢不能觸及底部形成支撐。實(shí)驗(yàn)包括兩階段，大鼠先預(yù)游3 min，再記錄之后5 min內(nèi)大鼠不動(dòng)時(shí)間。每天每只大鼠僅測(cè)量1次，1只大鼠測(cè)量后更換清潔水以防上只大鼠氣味干擾，再進(jìn)行下只大鼠測(cè)量。每只大鼠連續(xù)測(cè)量7 d，取最后3 d均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 Western blot法測(cè)定海馬組織BDNF含量

大鼠末次行為學(xué)測(cè)定24 h后，待大鼠麻醉迅速心臟取血，脫頸處死后將大鼠置于冰臺(tái)上，分離取出海馬組織。每100 mg海馬組織中加入500 μL的RIPA裂解液(含30 ul蛋白酶抑制劑)，用無菌的眼科剪充分剪碎組織后，冰浴環(huán)境下用超聲細(xì)胞破碎儀勻漿20 s，冰浴上靜置裂解20 min；4 ℃ 12000 r/min離心10 min，收集上清液。使用Western blot法測(cè)定大鼠海馬組織BDNF含量。

2.7 胸主動(dòng)脈及大腦中動(dòng)脈HE染色

大鼠取出海馬組織后，迅速分離出胸主動(dòng)脈及大腦中動(dòng)脈，置于4%多聚甲醛溶液中固定，采用HE染色法處理，顯微鏡攝片。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 胸主動(dòng)脈及大腦中動(dòng)脈病理學(xué)改變

圖1、2顯示，HE染色及顯微鏡攝片顯示，空白對(duì)照組胸主動(dòng)脈及大腦中動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)未見明顯異常；抑郁高脂氟西汀組和抑郁高脂模型組可見病理性內(nèi)膜中膜增厚，少許脂質(zhì)沉積，外膜部分細(xì)胞空泡變性，未見明顯脂質(zhì)斑塊；抑郁高脂GXII組可見內(nèi)膜中膜少許增厚，提示GXII對(duì)心腦動(dòng)脈可能具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用。

3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1顯示，與空白對(duì)照組比較，抑郁模型組、抑郁高脂模型組的大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)總距離縮短及強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加(P<0.05)，提示抑郁造模成功。與抑郁模型組比較，抑郁氟西汀組、抑郁GXII組的大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)總距離增加及強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短(P<0.05)；與抑郁高脂模型組比較，抑郁高脂氟西汀組、抑郁高脂GXII組的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)總距離增加及強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短(P<0.01，P<0.05)，提示鹽酸氟西汀及GXII具有抗抑郁樣作用。抑郁氟西汀組和抑郁GXII組、抑郁高脂氟西汀組和抑郁高脂GXII組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示鹽酸氟西汀和GXII抗抑郁作用療效比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：A.空白對(duì)照組；B.抑郁高脂模型組；C.抑郁高脂氟西汀組；D.抑郁高脂GXII組圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化比較(HE ×400)

注：A.空白對(duì)照組；B.抑郁高脂模型組；C.抑郁高脂氟西汀組；D.抑郁高脂GXII組圖2 各組大鼠大腦中動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化比較(HE ×400)

表1 冠心II號(hào)方對(duì)大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和BDNF表達(dá)影響比較

注：與空白對(duì)照組比較：#P<0.05，##P<0.01；與抑郁模型組比較：+P<0.05，++P<0.01；與抑郁高脂模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.3 海馬BDNF含量變化

表1顯示，與空白對(duì)照組比較，抑郁模型組、抑郁高脂模型組的海馬BDNF含量減少(P<0.01)，提示抑郁造模成功。與抑郁模型組比較，抑郁氟西汀組、抑郁GXII組的海馬BDNF含量增加(P<0.01，P<0.05)；與抑郁高脂模型組比較，抑郁高脂氟西汀組、抑郁高脂GXII組的海馬BDNF含量增加(P<0.01，P<0.05)，提示鹽酸氟西汀及GXII具有上調(diào)海馬BDNF表達(dá)的作用。抑郁氟西汀組和抑郁GXII組、抑郁高脂氟西汀組和抑郁高脂GXII組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示鹽酸氟西汀和GXII抗抑郁作用療效比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

早在東漢時(shí)期，著名醫(yī)家華佗在《青囊秘錄》中說：“善醫(yī)者，必先醫(yī)其心，而后醫(yī)其身，其次則醫(yī)其病?！苯┠辍半p心醫(yī)學(xué)”的發(fā)展[4]，使醫(yī)務(wù)工作者對(duì)身心疾病的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步提高，CHD合并抑郁癥患者的治療得到醫(yī)務(wù)界廣泛關(guān)注。這種“雙心醫(yī)學(xué)”的模式體現(xiàn)，是“以人為本”即從“治病”到“治病人”。

GXII是郭士魁大師、陳可冀院士于上個(gè)世紀(jì)60年代提出的中藥復(fù)方，具有活血化瘀之功效，用于治療CHD[6]。此方由中藥丹參、川芍、赤芍、紅花和降香5味傳統(tǒng)中藥按照2∶1∶1∶1∶1比例組成，現(xiàn)有中成藥制劑，包括精制冠心片、精制冠心顆粒、精制冠心軟膠囊和膠囊等，被收錄于《中華人民共和國藥典》。國內(nèi)研究證明，GXII對(duì)CHD具有確切的臨床治療效果[5]，可改善血液流變性及微循環(huán)，抑制血小板積聚，預(yù)防血栓形成，降血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化，提高耐缺氧能力，抗心肌梗死、心肌細(xì)胞凋亡、抗氧化、增加冠脈血流量、抗炎等諸多作用[5-9]。

本研究大鼠胸主動(dòng)脈及大腦中動(dòng)脈病理學(xué)改變表明，抑郁高脂GXII組能改善胸主動(dòng)脈及大腦中動(dòng)脈病理改變，提示GXII對(duì)心腦動(dòng)脈可能具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用。該結(jié)論與上述GXII心臟保護(hù)作用相一致[5-9]。本研究大鼠行為學(xué)檢測(cè)表明，GXII能增加曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)總距離，縮短強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，提示GXII具有抗抑郁樣作用。

神經(jīng)營養(yǎng)學(xué)說是目前抑郁癥機(jī)制研究的重要學(xué)說之一。BDNF在神經(jīng)細(xì)胞的再生、存活、分化、功能維持和突觸的傳遞、重塑性方面發(fā)揮著重要作用[10-11]。文獻(xiàn)報(bào)道，BDNF與大腦記憶和學(xué)習(xí)功能密切相關(guān)，其機(jī)制可能與BDNF廣泛分布于海馬及皮層組織有關(guān)[12]。此外，BDNF表達(dá)與CHD也相關(guān)，研究表明CHD患者血清中BDNF水平升高[13]。BDNF與血管內(nèi)皮細(xì)胞存活、增殖、移行密切相關(guān)，并在動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性心肌病等疾病中表達(dá)改變。BDNF表達(dá)缺陷會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)異常及心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[14]。這些研究提示，BDNF可能在抗抑郁及心臟保護(hù)中扮演重要角色。本研究大鼠海馬BDNF表達(dá)測(cè)定表明，GXII可提高CUMS聯(lián)合高脂大鼠模型海馬組織BDNF表達(dá)水平，提示GXII具有抗心腦動(dòng)脈粥樣硬化及抗抑郁樣作用，其作用可能與上調(diào)海馬組織BDNF表達(dá)相關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“胸痹心痛”與“郁病”二者之間有聯(lián)系。中醫(yī)整體觀認(rèn)為，形是人的形體，神是人的精神意識(shí)思維活動(dòng)，神形合二為一構(gòu)建人體。CHD合并心境低落乃是情志與臟腑功能活動(dòng)失調(diào)，即“形神失和”。中醫(yī)藏象學(xué)說認(rèn)為，腦為元神之府，心腦共主神明，即心腦血脈相通，共為神明之府，共同主宰人體生命活動(dòng)，產(chǎn)生意識(shí)思維并支配其相應(yīng)行為。《黃帝內(nèi)經(jīng)》提出心主血脈，心藏神。一方面，心臟搏動(dòng)推動(dòng)血液流注全身，濡養(yǎng)人體五臟六腑形體官竅；另一方面，心為君主之官，神明出焉，即心主宰人體精神意識(shí)思維活動(dòng)。因心腦共為神明之府，又有血脈相通，故“一處神明傷，則兩處俱傷”。腦之神明傷可累及于心，心之神明傷可累及于腦。中醫(yī)病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，中醫(yī)學(xué)對(duì)“胸痹心痛”的認(rèn)識(shí)是因年老體虛、飲食不當(dāng)、情志失調(diào)、寒邪內(nèi)蘊(yùn)等多種原因?qū)е滦拿}痹阻、氣滯血瘀，其病位在心，病機(jī)為氣滯血瘀。而郁病多由情志內(nèi)傷引起，其病機(jī)主要以氣機(jī)郁滯為主常兼血瘀，二者共同的病機(jī)為“氣滯血瘀”。王階等[3]對(duì)CHD合并抑郁癥進(jìn)行了相關(guān)中醫(yī)證候特征研究，并提出CHD合并抑郁癥的中醫(yī)證候要素特點(diǎn)為血瘀、氣虛、肝郁、氣滯、痰濁等，其中“氣滯血瘀”被提到重要地位。綜上，“心腦共主神明”學(xué)說及“胸痹心痛”“郁病”二者共同的病機(jī)皆為氣滯血瘀，這些構(gòu)建了“腦心同治”的中醫(yī)學(xué)治療原則，即CHD合并抑郁癥有共同的病理變化基礎(chǔ)，因此“行氣活血”是中醫(yī)治療“胸痹心痛”與“郁病”共同的指導(dǎo)原則[15]。GXII作為活血化瘀療法的代表方藥，一方面對(duì)“胸痹心痛”患者通過活血化瘀、通絡(luò)止痛以達(dá)成祛瘀通脈、行氣止痛之效，另一方面對(duì)“郁病”患者通過活血化瘀、理氣解郁以達(dá)成行氣開郁之效。心腦血脈相通共為神明之府，運(yùn)用活血化瘀經(jīng)典中藥復(fù)方GXII同時(shí)治療“胸痹心痛”及“郁病”，體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)“腦心同治”的治療原則。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GXII具備抗心腦動(dòng)脈粥樣硬化樣保護(hù)作用及抗抑郁樣作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)海馬組織BDNF表達(dá)相關(guān)。本研究體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)“腦心同治”，可能為治療抑郁癥合并CHD患者提供臨床用藥參考。但其具體作用通路、作用途徑仍不明確，尚需今后進(jìn)一步的深入研究。