高秀花，劉旭光，晉 松，楊慎峭，周海燕，楊 馨，賈 敏

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075；3.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，RA病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，纏綿難愈，屬國內(nèi)外廣泛關(guān)注的疑難疾病。RA發(fā)病機(jī)制主要是CD4+T淋巴細(xì)胞分化異常，既往研究認(rèn)為輔助性T細(xì)胞1(T helper cells 1，Th1)/輔助性T細(xì)胞2(T helper cells 2，Th2)平衡在RA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1]。然而隨著研究的深入和輔助性T細(xì)胞17(T helper cells 17，Th17)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)的發(fā)現(xiàn)，人們認(rèn)識到Th17/Treg失衡在RA的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，且RA存在向Th17方向偏離的現(xiàn)象[2]。因此以Treg/Th17為靶點(diǎn)治療RA的研究逐漸受到關(guān)注，如獲得臨床滿意療效的抗IL-17 A 和IL-17RA抗體的研究，但其不良反應(yīng)不可忽視[3]。

艾灸治療RA安全無毒副作用，抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用確切，但艾灸能否影響RA中Th17/Treg平衡尚未見報(bào)道。為進(jìn)一步闡釋艾灸的科學(xué)內(nèi)涵和作用機(jī)理，我課題組基于前期課題研究，從艾灸治療RA的抗炎作用出發(fā)，以Th17/Treg平衡為切入點(diǎn)，運(yùn)用ELISA、RT-PCR等技術(shù)，從對Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)/白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)以及Th17/Treg細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(Retinoid related orphan receptor，RORγt)/叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3(Foxhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)表達(dá)的影響，分別探索艾灸對RA中 Th17/Treg平衡的影響，以期更加深入地揭示艾灸的作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動物

日本大耳白兔30只(動物、飼料均由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，批號SCXK(川)2008-14，合格證號川實(shí)動管字089號)，雌雄各半，體質(zhì)量(2.5±0.25)kg，實(shí)驗(yàn)過程中所有處置符合相關(guān)動物倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑及儀器

弗氏完全佐劑Sigma公司(貨號Lot101M8711)；兔IL-17、IL-10 ELISA試劑盒(Abcam公司，貨號分別為DRE95204、DRE95029)；總RNA抽提試劑(Invitrogen公司，批號15596-026)；酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司，型號Multlskan Mk3)；RT-PCR儀(ThermoFisher儀器有限公司，型號PIKORed 96)；電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號JY200C)；RT-PCR反應(yīng)試劑盒、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司，批號分別為BK402、BK3303、BK501)；艾粒(中國南陽東升艾灸廠，規(guī)格Ф6.8×26 mm，批號2014032)。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備

適應(yīng)性馴養(yǎng)家兔7 d后，將家兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組(簡稱“空白組”)、RA模型組(簡稱“模型組”)、艾灸治療組(簡稱“治療組”)3組各10只。

選用RA經(jīng)典動物模型造模：馴養(yǎng)7 d后，將治療組、模型組家兔雙側(cè)后膝關(guān)節(jié)剃毛暴露，10%異丙醇進(jìn)行皮膚消毒，輕度屈曲膝關(guān)節(jié)，定位膝關(guān)節(jié)髕骨下緣、髕韌帶外側(cè)凹陷為穿刺點(diǎn)，按0.5 ml/kg體質(zhì)量劑量將弗氏完全佐劑平均注入家兔雙側(cè)后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，同法空白組家兔注入無菌生理鹽水[4]。

2.2 治療

于造模后1周將治療組家兔固定在兔架上，暴露施灸部位(每處剃毛約2×2 cm2)，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]的動物穴位圖譜，將艾粒黏貼于雙側(cè)“足三里”“腎俞”穴，每穴連續(xù)施灸5壯，每日1次，6 d為1個療程，療程期間休息1 d，共治療3個療程?？瞻捉M和模型組同法抓取固定，但不施灸。3組同步，操作均在上午9∶00～11∶00之間進(jìn)行。

2.3 膝關(guān)節(jié)周長測定

分別于造模前后及治療第1、2、3周測定所有家兔的左右后肢膝關(guān)節(jié)周長，測量使用軟尺過膝關(guān)節(jié)髕骨下緣、髕韌帶外側(cè)凹陷的穿刺點(diǎn)。

2.4 取樣及指標(biāo)檢測

治療第3周結(jié)束(治療第21天)，于9∶00～11∶00間進(jìn)行標(biāo)本采集。

2.4.1 滑膜液抽取及相關(guān)指標(biāo)檢測 耳緣靜脈注射空氣處死家兔，分別在雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水0.3 ml，輕揉局部后無菌條件下抽吸關(guān)節(jié)腔中滑膜液約0.3 ml裝入EP管，-20 ℃低溫保存。根據(jù)試劑盒說明書，運(yùn)用ELISA雙抗夾心法測定滑膜液量中IL-10、IL-17，并計(jì)算IL-10/IL-17比值。

2.4.2 滑膜組織取材及相關(guān)指標(biāo)檢測 抽取滑膜液后，沿著雙后膝關(guān)節(jié)正中線縱行剖開皮膚，直至暴露以膝關(guān)節(jié)為中心的區(qū)域大小約為3×3 cm2，使用齒鑷提起髕骨，沿髕骨上緣大約0.3～0.4 cm處向下切至股骨，再沿髕骨兩側(cè)向下分離到脛骨，肉眼可見一層淡黃色滑膜組織自髕骨下緣向上延續(xù)。完全暴露滑膜組織，用眼科鑷輕夾其游離端，使用刀片完整切下，-70 ℃保存待測。運(yùn)用RT-PCR法測定滑膜組織中Foxp3mRNA、RORγtmRNA表達(dá)量，并計(jì)算Foxp3/RORγt比值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 艾灸對實(shí)驗(yàn)性RA家兔膝關(guān)節(jié)周長影響

表1 3組家兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)周長比較

注:與空白組比較:**P<0.01；與模型組比較:△△P<0.01

表1顯示,造模前，各組家兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)周長比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性；造模后，模型組、治療組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)周長均較空白組有明顯升高(P<0.01)，而2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，說明造模成功。治療第1、2、3周，模型組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)周長較空白組均明顯升高(P<0.01)，而治療組較模型組均明顯降低(P<0.01)。

3.2 艾灸對實(shí)驗(yàn)性RA家兔滑膜液Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-17/IL-10含量以及滑膜組織Th17/Treg關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt/Foxp3表達(dá)的影響

表2顯示,與空白組比較，模型組滑膜液中IL-10含量偏低(P<0.05)，IL-17含量明顯偏高(P<0.01)，IL-10/IL-17值明顯偏低(P<0.01)；滑膜組織中Foxp3mRNA的表達(dá)存在下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，RORγtmRNA表達(dá)則升高(P<0.05)，F(xiàn)oxp3/RORγt值降低(P<0.05)。與模型組比較，治療組IL-10含量偏高(P<0.05)，IL-17含量偏低(P<0.05)，IL-10/IL-17值偏高(P<0.05)；Foxp3mRNA表達(dá)存在升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；RORγtmRNA表達(dá)降低(P<0.05)，F(xiàn)oxp3/RORγt值存在升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 3組家兔滑膜液中IL-10、IL-17含量及滑膜組織中Foxp3mRNA、RORγtmRNA表達(dá)量比較

注：與空白組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05

4 討論

RA屬于系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，其病因及其發(fā)病機(jī)制尚不明確[6]?；ぱ装Y為主要病理改變，其臨床表現(xiàn)為對稱性發(fā)生的多關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為局部紅、腫、熱、痛。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇測量日本大耳白兔的膝關(guān)節(jié)周長，從宏觀角度判斷炎癥程度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究造模成功，通過對3組家兔的充分比較說明艾灸具有明顯的消腫和抗炎作用。

隨著現(xiàn)代免疫學(xué)的不斷發(fā)展，大量的研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg失衡存在于包括RA在內(nèi)的多種自身免疫性疾病中，且此平衡有向Th17方向偏離的現(xiàn)象，以Th17/Treg平衡為靶點(diǎn)對RA治療的研究也越來越受到關(guān)注。Park和Harrington于2005年首次提出“Th17細(xì)胞”的概念，它是在轉(zhuǎn)錄因子RORγt調(diào)控下以分泌IL-17為主要特點(diǎn)的新型Th細(xì)胞亞群，是重要的致炎細(xì)胞[7-8]；Sakaguchi于上世紀(jì)90年代首先提出Treg的概念，是一群具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能的CD4+T細(xì)胞[9]，主要通過分泌IL-10抑制炎癥反應(yīng)，特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，可以降低RORγt表達(dá)，從而抑制Th17細(xì)胞功能。Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的生物學(xué)作用既相互拮抗又相互關(guān)聯(lián)，保持動態(tài)平衡，對正常免疫應(yīng)答的維持、防止自身免疫性疾病的發(fā)生具有非常重要的意義。因此，糾正Th17/Treg失衡狀態(tài)將會成為RA治療的新思路和新方法。

RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”范疇，“內(nèi)外相合”因而致痹，因此其病機(jī)關(guān)鍵是邪正交爭中的邪侵與正虛[10]，病性屬于“虛實(shí)夾雜”或“本虛標(biāo)實(shí)”，致機(jī)體經(jīng)絡(luò)閉阻，不榮則痛或不通則痛?！鹅`樞·官能》中“針?biāo)粸?，灸之所宜”是對灸法的高度評價，并善于溫經(jīng)通絡(luò)止痛、扶陽補(bǔ)腎固本。故本實(shí)驗(yàn)治療同樣選用先后天之本同固的“腎俞”“足三里”穴，共奏溫腎健脾、補(bǔ)益氣血、活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)標(biāo)本同治之效[11]。

已有大量臨床及基礎(chǔ)研究證實(shí)，RA的治療中艾灸療效確切，具有明顯的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。如艾灸能明顯改善Th1/Th2細(xì)胞因子失衡[12]、胸腺萎縮和脾臟腫大等免疫紊亂狀態(tài)，明顯抑制滑膜炎癥和滑膜細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子[13-14]等。本實(shí)驗(yàn)著重觀察艾灸對實(shí)驗(yàn)性RA Th17/Treg平衡的影響，研究發(fā)現(xiàn)模型組滑膜液中IL-10含量低于空白組，IL-17則明顯升高，IL-10/IL-17值明顯降低，提示RA中存在Th17/Treg細(xì)胞因子失衡，且有向Th17方向偏離的現(xiàn)象；治療后IL-10含量高于模型組，IL-17則降低，IL-10/IL-17值亦升高。提示艾灸能夠有效升高實(shí)驗(yàn)性RA滑膜液中異常降低的IL-10水平，降低異常升高的IL-17水平，升高異常降低的IL-10/IL-17比值，從而有效調(diào)整Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子平衡。與空白組比較，模型組滑膜組織Foxp3mRNA表達(dá)有下降趨勢(但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，RORγtmRNA表達(dá)則升高，F(xiàn)oxp3/RORγt比值降低，提示實(shí)驗(yàn)性RA中存在Th17/Treg關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)失衡，且有向Th17方向偏離的現(xiàn)象；治療后Foxp3mRNA表達(dá)有升高趨勢(但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，RORγtmRNA表達(dá)則降低，F(xiàn)oxp3/RORγt比值有升高趨勢(但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。提示艾灸能夠有效升高異常降低的Foxp3表達(dá)水平，降低RORγt的異常高表達(dá)，可能使異常降低的Foxp3/RORγt比值升高，從而有效調(diào)整Th17/Treg細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子平衡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為艾灸對實(shí)驗(yàn)性RA具有確切的抗炎效應(yīng)，可調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性RA的 Th17/Treg平衡，這可能就是艾灸抗炎作用的重要機(jī)制之一。因?qū)嶒?yàn)當(dāng)時Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)抗兔流式抗體生產(chǎn)滯后，本課題未能使用流式細(xì)胞術(shù)檢測，今后條件成熟，可以直接運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)等檢測技術(shù)，對Th17、Treg細(xì)胞的理化特性進(jìn)行檢測，可更加直接準(zhǔn)確地研究艾灸對Th17/Treg平衡的影響。