尹雪莉，張勝權(quán)，張學(xué)軍

銀屑病(psoriasis，Pso)確切的病因和發(fā)病機制至今仍未完全闡明，是皮膚科領(lǐng)域亟待解決的難題之一[1-5]。全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(genome-wide association study，GWAS)成為發(fā)現(xiàn)復(fù)雜疾病易感基因最常用的方法之一。GWAS發(fā)現(xiàn)大量Pso易感基因，其中具有免疫功能的白介素28受體ɑ(IL-28 receptor α，IL28RA)基因為中國漢族人Pso和系統(tǒng)性紅斑狼瘡共有易感基因，也是歐洲人群Pso的易感基因[6-7]。IL28RA在正常皮膚組織呈中度表達，在原代角質(zhì)形成細胞和永生HaCaT角質(zhì)形成細胞中高表達[8-9]。既然IL28RA是Pso易感基因，因此，IL28RA基因可能在Pso發(fā)生發(fā)展中扮演很重要的角色。該研究通過構(gòu)建pCMV6-IL28RA重組體并轉(zhuǎn)染HaCaT細胞，建立IL28RA過表達細胞模型進而觀察IL28RA對HaCaT細胞遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞、質(zhì)粒和細菌 pCMV6質(zhì)粒(cat. no. PS100001)購自美國OriGene公司；E.coliDH5α感受態(tài)細菌由本實驗室保存；HaCaT細胞購自中科院上海細胞庫。

1.1.2主要試劑 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自美國Promega 公司；Lipofectamine 3000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen 公司；限制性內(nèi)切核酸酶HindⅢ、XhoⅠ、T4 連接酶、Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本Takara公司；PCR引物及RT-qPCR引物由上海生工生物公司合成；G418購自美國Sigma公司；DMEM 培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計和HepG2細胞培養(yǎng)及總RNA提取 根據(jù)NCBI Genbank 序列提供的人IL28RA mRNA 序列利用primier 5.0 軟件設(shè)計引物，上游引物：AGAATGTGACGCTGCTCTCC；下游引物：GCCGGCTCCACTTCAAAAAG。HepG2細胞培養(yǎng)及總RNA提?。簭?fù)蘇HepG2細胞，將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中用含10% 胎牛血清和1%的青霉素、鏈霉素雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)，待其融合80%，棄培養(yǎng)基用2 ml PBS洗3次后加入1 ml Trizol試劑，放置于冰上裂解，提取細胞總RNA。

1.2.2總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA和PCR擴增IL28RA 利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將上步總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。該方法分2步：① 逆轉(zhuǎn)錄加入0.5 μl Oligo dTPrimer，0.5 μl dNTP Mixture，4 μl RNA，無RNase 水4 μl，70 ℃ 15 min 并迅速放置于冰上；② 上述變性反應(yīng)液中加入5×PrimeScript Buffer 2 μl，RNase Inhibitor 0.25 μl，PrimeScript RTase 0.5 μl，無RNase 水2.15 μl。點動離心，30 ℃、10 min，42 ℃、60 min，70 ℃、15 min。待反應(yīng)結(jié)束后將其放置在-20 ℃冰箱中備用。PCR擴增IL28RA：依次加入2 μl cDNA，10×PCR Buffer 2.5 μl，0.5 μl上游引物，0.5 μl下游引物，MgCl21.5 μl，2.5 μl dNTP Mixture，TaqDNA Polymerase 1 μl，14.5 μl去離子水。94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，40 ℃、30 s，72 ℃、2 min，進行35 個循環(huán)，72 ℃、5 min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.3真核表達載體構(gòu)建 分別用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、XhoⅠ將IL28RA的PCR片段和質(zhì)粒pCMV6進行雙酶切，純化回收、連接。瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切實驗結(jié)果并進行膠回收?；厥盏拿盖挟a(chǎn)物按質(zhì)粒pCMV6和IL28RA PCR產(chǎn)物1 ∶8的比例加入T4連接酶體系，在15 ℃條件下連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細菌中，并涂布在固體LB 平板(25 μg/ml卡那霉素)上生長，觀察平板菌落并挑取單克隆菌落接種于 LB 液體培養(yǎng)基中進行37 ℃振蕩過夜，用基因組DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒pCMV6-IL28RA，并酶切，電泳鑒定和采取1.5 ml細菌培養(yǎng)物送至上海生工生物公司測序。

1.2.4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HaCaT細胞 待HaCaT細胞生長良好時，將其種入24孔板，每孔1×105個細胞。待其融合80%時先換成無抗生素無血清的DMEM 并利用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 分別將對照pCMV6 和重組IL28RA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HaCaT細胞，6 h 后換成完全DMEM 培養(yǎng)基。48 h 后加入終濃度為400 ng/ml 的G418 進行篩選，每2 d 換1次培養(yǎng)基，4周后可觀察到空白對照組細胞全部死亡，而轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒組、過表達組細胞瓶中仍有細胞存在，說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功。細胞培養(yǎng)瓶中維持400 ng/ml G418 培養(yǎng)轉(zhuǎn)染成功的細胞。

1.2.5RT-qPCR法檢測IL28RA mRNA相對表達水平 將HaCaT未轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pCMV6 和過表達質(zhì)粒 pCMV6-IL28RA的細胞分別接種24孔板(細胞接種密度為1×105)，當細胞融合70%～80%時，用Trizol試劑提取每種細胞總RNA測定總RNA濃度，根據(jù)RT-qPCR說明書進行檢測，甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)(上游引物：AGATCATCAGCAATGCCTCCTG，下游引物：ATGGCATGGACTGTGGTCATG)作為內(nèi)參對照。反應(yīng)體系為20 μl：2×SYBR Mix 10 μl，DEPC H2O 8 μl，cDNA 1 μl，上下游引物分別各0.5 μl。于7500 qPCR 系統(tǒng)：95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性 15 s、60 ℃退火20 s、72 ℃ 2 min，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt進行兩組間IL28RA mRNA相對表達量計算。

1.2.6傷口愈合法檢測IL28RA對HaCaT細胞遷移能力影響 將HaCaT未轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pCMV6細胞和過表達pCMV6-IL28RA的細胞分別種于12孔培養(yǎng)板中以5000細胞/ml鋪板兩塊。孵育細胞24 h，使用10 μl無菌移液管尖進行劃痕，產(chǎn)生匯合單層傷口，形成傷口后分別在0 h和48 h拍攝照片。

2 結(jié)果

2.1 IL28RA基因編碼序列的獲得從HepG2細胞中提取RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，然后利用引物擴增出 IL28RA的編碼序列，全長1 563 bp，見圖1A。

2.2 IL28RA真核表達載體的構(gòu)建及鑒定獲取IL28RA基因全長后，經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化。挑取單克隆菌落進行PCR及擴大培養(yǎng)后進行酶切并測序。酶切質(zhì)粒得到5 000 bp左右pCMV6條帶及1 563 bp左右的IL28RA 條帶，見圖 1B。經(jīng)NCBI blast 比對證明質(zhì)粒測序結(jié)果正確，見圖1C。

2.3 RT-qPCR法分析轉(zhuǎn)染后IL28RA mRNA在HaCaT中表達情況及分析其對HaCaT細胞遷移能力影響將未轉(zhuǎn)染HaCaT細胞、轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pCMV6細胞和過表達pCMV6-IL28RA的細胞接種12孔板，至90%融合時，收集細胞并提取細胞RNA，結(jié)果顯示與對照組pCMV6相比，過表達組IL28RA mRNA相對表達水平(0.751 7±0.050 7)高于pCMV6對照組(4.442 0±0.621 1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.032,P<0.05)。細胞傷口愈合實驗表明，過表達IL28RA組(68.543 3±3.946 1)48 h細胞遷移未愈合面積百分比大于pCMV6組(42.786 7±2.049 7)和HaCaT組(50.913 3±2.413 6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=79.01,P<0.01)，同時也表明IL28RA基因過表達使得HaCaT細胞遷移減慢。見圖2。

3 討論

Pso是一種以表皮角質(zhì)形成細胞過度增殖為特征的慢性炎癥性皮膚病，影響世界總?cè)丝跀?shù)2%左右[10]。GWAS發(fā)現(xiàn)IL28RA是中國漢族人Pso易感基因，但該基因在Pso中發(fā)病機制尚不明確[7]。IL28RA基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物屬于Ⅱ類細胞因子受體家族[11]。人類IL28RA在膀胱癌、白血病、乳腺癌、頭頸癌和肺癌組織等中表達，在人類的免疫系統(tǒng)呈中度表達[8]。Meta分析IL28RA基因在癌癥的預(yù)后價值，研究[12]顯示IL28RA在癌癥中表達越低，患者預(yù)后越差。IL-29、IL-28A、IL-28B結(jié)合到該受體上，能誘導(dǎo)構(gòu)象變化促使其與另一個受體IL10R2形成受體配體復(fù)合物，激活激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子信號通路，發(fā)揮干擾素λ抗病毒、抗增殖功效[9]。Dumoutier et al[13]研究顯示IL-29抗增殖及抗病毒作用取決于IL28RA絡(luò)氨酸343和517兩個位點，當受體兩位點處絡(luò)氨酸突變?yōu)楸奖彼?，IL-29抗增殖及抗病毒作用消失。因此，IL28RA在IL-29抗病毒和抗增殖中起著決定性作用。由此可見，IL28RA可能對細胞的功能有重要的調(diào)控作用(如增殖、分化、凋亡等)，還可能參與機體的免疫活動調(diào)節(jié)。

圖1 IL28RA 基因的擴增及重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

A：IL28RA基因 PCR擴增圖；B：IL28RA基因重組質(zhì)粒酶切鑒定圖；C：重組質(zhì)粒部分測序結(jié)果;M：DNA Marker；1：IL28RA基因全長 PCR 產(chǎn)物；2：雙酶切IL28RA 重組質(zhì)粒；3：雙酶切 pCMV6質(zhì)粒

本研究旨在通過構(gòu)建IL28RA基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染使其在人永生皮膚角質(zhì)形成細胞HaCaT中過表達，觀察過表達IL28RA基因?qū)aCaT細胞遷移能力影響。首先利用基因重組技術(shù)將IL28RA基因編碼區(qū)插入質(zhì)粒pCMV6中，并用RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后IL28RA基因在HaCaT細胞中的mRNA相對表達量，結(jié)果顯示過表達IL28RA成功轉(zhuǎn)染HaCaT細胞；隨后用細胞傷口愈合實驗檢測IL28RA基因過表達對細胞遷移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達IL28RA細胞，48 h后細胞遷移未愈合面積百分比大于pCMV6組和HaCaT組即與對照細胞相比，過表達IL28RA能抑制HaCaT細胞遷移。本研究中IL28RA作為細胞膜上受體，需要相應(yīng)的配體刺激(如IL-29)進而發(fā)揮其功能。然而在傷口愈合實驗中，加入終濃度為100 ng/ml IL-29處理細胞，同時增加IL-29濃度和作用時間(圖2)，但是IL-29加入并未改變IL28RA對傷口愈合面積的影響，其中具體機制還需要進一步研究。本研究為進一步探討IL28RA生物學(xué)功能及其在Pso中發(fā)病機制研究奠定了基礎(chǔ)。

圖2 傷口愈合實驗檢測IL28RA基因過表達對HaCaT細胞遷移能力的影響

與pCMV6組比較：**P<0.01；與未轉(zhuǎn)染HaCaT組比較：##P<0.01