梁正儀，鄧秀英

圍產(chǎn)期抑郁(perinatal depression, PND)是一種在孕期高發(fā)的精神類疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約20%的女性在孕期被認(rèn)為患有抑郁癥[1]。圍產(chǎn)期抑郁不僅僅會(huì)影響胎兒的發(fā)育，導(dǎo)致胎兒胎盤功能受損、胎兒生長(zhǎng)下降等多種癥狀[2]；同時(shí)也會(huì)影響兒童的生長(zhǎng)和發(fā)育，具體表現(xiàn)為發(fā)育延遲，出現(xiàn)焦慮、認(rèn)知和注意力缺陷等行為和情感控制方面的問題[3]。因此，采用有效的治療方法既有利于改善母親疾病，也有助于優(yōu)生優(yōu)育。

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一種omega-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是突觸膜、突觸囊泡等部位。研究[4]顯示，缺乏DHA會(huì)使動(dòng)物在認(rèn)知和行為測(cè)試中降低學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)能力。此外，各級(jí)神經(jīng)退行性疾病也與低水平的DHA相關(guān)，但補(bǔ)充DHA可改善癥狀[5]。本研究擬評(píng)估處于抑郁狀態(tài)下孕鼠的子代的抑郁狀行為和認(rèn)知能力，以及孕鼠服用DHA后子代抑郁狀行為和認(rèn)知能力的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用40 d左右的未受孕過的C57雌性小鼠同批交配，在交配10～12 h后發(fā)現(xiàn)陰栓即為交配成功。選取30只成功受孕母鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、束縛應(yīng)激組及DHA組。子鼠出生后正常飼養(yǎng)。所有小鼠均飼養(yǎng)在溫度為 (21±3)℃ 和濕度為55%±3%環(huán)境中, 小鼠可以自由的獲得食物并飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將孕鼠束縛應(yīng)激21 h，每天腹腔注射DHA(10 mg/kg)。22 h后小鼠出生后正常飼養(yǎng)。在小鼠出生30 h后，進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的抑郁狀態(tài)，通過新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和新位置實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠的認(rèn)知情況。并在行為實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用免疫組化法分析小鼠成年海馬神經(jīng)發(fā)生的變化，實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程

1.3 抑郁模型孕鼠制備在母鼠交配成功當(dāng)日，采用長(zhǎng)時(shí)間束縛的方法，每天束縛母鼠4 h，連續(xù)21 d，覆蓋母鼠整個(gè)孕期(21 d左右)。DHA給藥組是在每天束縛結(jié)束后腹腔注射(i.p.)DHA(10 mg/kg)。束縛應(yīng)激組是在每天束縛結(jié)束后腹腔注射生理鹽水。對(duì)照組是每天注射生理鹽水，沒有束縛。

1.4 子鼠抑郁行為檢測(cè)子鼠出生后4周通過懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的抑郁狀態(tài)。

1.4.1懸尾試驗(yàn) 小鼠尾巴末端的1 cm用夾子固定, 懸掛在離地面高60 cm的架子邊緣, 懸掛6 min, 記錄最后4 min內(nèi)小鼠的靜止時(shí)間。靜止?fàn)顟B(tài)的標(biāo)準(zhǔn)定為小鼠沒有明顯的掙脫行為。

1.4.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將小鼠放入高50 cm、直徑20 cm的塑料圓桶中6 min， 桶中水高為25 cm，水溫維持在25 ℃±3 ℃, 記錄最后4 min內(nèi)小鼠的靜止時(shí)間。靜止?fàn)顟B(tài)的標(biāo)準(zhǔn)定為小鼠沒有明顯的掙脫行為。

1.5 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)在一個(gè)80 cm×80 cm的盒子中進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)是基于嚙齒類動(dòng)物更喜歡探索新的物體，然后它們可以記住之前舊的物體的位置和形狀。

1.5.1新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前，將小鼠放入盒中適應(yīng)30 min后，第2天再開始實(shí)驗(yàn)。首先將兩個(gè)完全相同的物體放置在盒子的兩個(gè)角上，將小鼠放在盒子的正中心，讓小鼠自由探索30 min后，隨機(jī)取出一個(gè)物體，換另外一個(gè)新的物體，將小鼠重新放入盒中，觀察小鼠探索新放入物體的時(shí)間。探索比率= (探索新物的時(shí)間/探索總時(shí)間)×100%。

1.5.2新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前，將小鼠放入盒中適應(yīng)30 min后，第2天再開始實(shí)驗(yàn)。首先將兩個(gè)完全相同的物體放置在盒子的兩個(gè)角上，將老鼠放在盒子的正中心，讓小鼠自由探索30 min后，隨機(jī)移動(dòng)一個(gè)物體至另外一個(gè)未被使用的角上，將小鼠重新放入盒中，觀察小鼠探索新移動(dòng)物體的時(shí)間。探索比率= (探索新物的時(shí)間/探索總時(shí)間)×100%。

1.6 腦組織取樣及免疫組化① 腦片制備。海馬神經(jīng)發(fā)生的部位只在海馬齒狀回，所有小鼠在處死前1 d注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu，50 mg/kg)用以追蹤海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的狀態(tài)。腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠后，經(jīng)心臟灌注生理鹽水，再灌注4%福爾馬林溶液固定。取出腦后，繼續(xù)將腦部放入4%福爾馬林溶液后固定過夜。再分別用10%、20%和30%蔗糖溶液脫水各24 h。冷凍后，作厚度為30 μm的連續(xù)冠狀冰凍切片。腦片可置于PBS溶液中長(zhǎng)期保存。② 免疫組化分析。腦片經(jīng)過PBS洗滌后，BrdU抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，使用熒光標(biāo)記的二抗Alexa Fluor 488孵育2 h。PBS洗滌，然后用細(xì)胞核熒光劑DAPI孵育5 min。使用熒光顯微鏡觀察。③ 統(tǒng)計(jì)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目。將海馬以30 μm的連續(xù)冠狀冰凍切片，每個(gè)海馬可以獲得60～70片腦片。從每連續(xù)10片腦片隨機(jī)選取4片腦片進(jìn)行免疫組化處理。隨后，手動(dòng)數(shù)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目。由于海馬神經(jīng)發(fā)生僅僅發(fā)生在顆粒細(xì)胞下層，其余位置也會(huì)有細(xì)胞分裂，但是不是神經(jīng)干細(xì)胞分裂，有可能是膠質(zhì)細(xì)胞分裂。為了更一致的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，規(guī)定顆粒細(xì)胞層下0.5 mm為顆粒細(xì)胞下層，只統(tǒng)計(jì)在顆粒細(xì)胞下層BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目。面積(mm2)=0.5 mm×顆粒細(xì)胞下層的長(zhǎng)度(mm)。長(zhǎng)度通過Image J軟件測(cè)量。

2 結(jié)果

2.1 DHA對(duì)抑郁模型孕鼠子代抑郁狀態(tài)的影響強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)在小鼠出生后30 d進(jìn)行。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)孕期應(yīng)激的孕鼠子代較正常小鼠不動(dòng)時(shí)間更長(zhǎng)(F=66.4，P<0.001)，見圖2A，而孕期應(yīng)激的孕鼠在服用DHA后，其子代的不動(dòng)時(shí)間相對(duì)于束縛應(yīng)激組小鼠顯著縮短(P<0.001)，見圖2A。隨后的懸尾實(shí)驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)果，孕期受到束縛應(yīng)激的孕鼠，其子代不動(dòng)時(shí)間也顯著高于對(duì)照組小鼠(F=189.3，P<0.001)和孕期DHA喂食孕鼠的子代小鼠(P<0.001)，見圖2B。

2.2 DHA對(duì)抑郁模型孕鼠子代記憶能力的影響新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)在小鼠出生后30 d進(jìn)行。在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，相較于正常小鼠，束縛孕鼠子代對(duì)于新物體的偏好降低，表現(xiàn)在其對(duì)新物體探索的時(shí)間比例降低(F=40.4，P<0.001)，見圖3B。但是這種降低可以通過在孕期補(bǔ)充DHA而逆轉(zhuǎn)。相對(duì)于沒有補(bǔ)充DHA的孕鼠子代，補(bǔ)充DHA的孕鼠子代對(duì)新物體偏好增加，表現(xiàn)在其對(duì)新物體探索的時(shí)間比例增加(P<0.001)，見圖3B。在新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，束縛孕鼠子代對(duì)于處于新位置的物體偏好降低，表現(xiàn)在其對(duì)新位置的物體探索的時(shí)間比例降低(P<0.001)，見圖3D。但是在孕期補(bǔ)充了DHA孕鼠子代，相較于沒有補(bǔ)充DHA孕鼠子代，對(duì)新位置的物體的偏好增加，表現(xiàn)在其對(duì)新位置的物體探索的時(shí)間比例增加改善(P<0.001)，見圖3D。

2.3 DHA對(duì)抑郁模型孕鼠子代成年海馬神經(jīng)發(fā)生的影響采用免疫組化的方法分析小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層中BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)在小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行。相較于正常小鼠，束縛孕鼠子鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層中BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)目明顯降低(F=60.2，P<0.001)，見圖4。但是這種降低可以通過在孕期補(bǔ)充DHA而逆轉(zhuǎn)。相對(duì)于沒有補(bǔ)充DHA的孕鼠子代，補(bǔ)充DHA的孕鼠子代海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層中BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)目增加(P<0.001)，見圖4。

3 討論

本研究觀察到孕期抑郁可引起子代抑郁行為，并且該抑郁行為可以被DHA減緩改善。強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示孕鼠在長(zhǎng)期的束縛應(yīng)激條件下會(huì)引起子代產(chǎn)生抑郁樣的行為。這是由于胚胎期腦熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)小鼠海馬中BrdU陽性細(xì)胞數(shù),圖中箭頭所指細(xì)胞為BrdU陽性細(xì)胞；A：對(duì)照組小鼠的海馬BrdU免疫組化圖；B：束縛組小鼠的海馬BrdU免疫組化圖；C：DHA組小鼠的海馬BrdU免疫組化圖；D：不同組小鼠海馬中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與對(duì)照組比較：***P<0.01；與DHA組比較：###P<0.001

部的發(fā)育對(duì)于外界應(yīng)激非常敏感，圍產(chǎn)期抑郁母親會(huì)導(dǎo)致子代終生腦功能的改變，并對(duì)子代造成認(rèn)知、行為和情緒的問題[6]。在應(yīng)激孕鼠補(bǔ)充DHA后，發(fā)現(xiàn)DHA可以減緩子代鼠因母鼠孕期抑郁引起的抑郁狀行為。之前的研究[5]表明，具有圍產(chǎn)期抑郁的孕婦相較于正常孕婦，其DHA的含量顯著降低，增加DHA的補(bǔ)充可以降低獲得圍產(chǎn)期抑郁的風(fēng)險(xiǎn)。本研究顯示DHA不僅僅有助于降低獲得圍產(chǎn)期抑郁的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還可以達(dá)到治療和改善子代小鼠的作用。

圖2 DHA對(duì)抑郁模型孕鼠子代抑郁狀態(tài)的影響A：懸尾試驗(yàn)； B：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)；與對(duì)照組比較：***P<0.01；與DHA組比較：###P<0.001

圖3 DHA對(duì)抑郁模型孕鼠子代認(rèn)知能力的影響

A：新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)流程示意圖；B：新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C：新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)流程示意圖；D：新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與對(duì)照組比較：***P<0.01；與DHA組比較：###P<0.001

圖4 DHA對(duì)抑郁模型孕鼠子代成年海馬神經(jīng)發(fā)生的影響×10

海馬在大腦中參與記憶和情感控制，一般認(rèn)為背側(cè)海馬參與學(xué)習(xí)和記憶，腹側(cè)海馬參與情感控制。抑郁情況下會(huì)引起海馬結(jié)構(gòu)和功能異常[7]。海馬功能異常會(huì)導(dǎo)致和海馬依賴性認(rèn)知功能受損。產(chǎn)前應(yīng)激對(duì)胚胎的發(fā)育產(chǎn)生影響，導(dǎo)致胚胎海馬發(fā)育受損[8]，但是海馬發(fā)育受損是否對(duì)子代認(rèn)知功能產(chǎn)生影響，還不清楚。因此，本研究采用新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)前應(yīng)激對(duì)子代記憶的影響。結(jié)果表明產(chǎn)前應(yīng)激子代小鼠對(duì)于新物體和新位置的物體的探索時(shí)間相較于正常小鼠下降，顯示產(chǎn)前應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠海馬依賴性的記憶能力下降。DHA處理后，子代小鼠對(duì)于新物體和新位置的物體的探索時(shí)間增加，該結(jié)果顯示海馬依賴性的記憶能力得到了改善。這些結(jié)果顯示DHA不僅可能通過改善海馬功能，增加認(rèn)知作用[9]，也可以改善胚胎期海馬發(fā)育過程的損傷。

海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層是成年大腦中少數(shù)幾個(gè)具有神經(jīng)干細(xì)胞的區(qū)域。神經(jīng)干細(xì)胞分化生成新的神經(jīng)元的過程稱為成年海馬神經(jīng)發(fā)生(adult hippocampal neurogenesis, AHN)。AHN和海馬的結(jié)構(gòu)功能密切相關(guān)，海馬形態(tài)和功能發(fā)生改變會(huì)導(dǎo)致AHN降低[10]。增加AHN可以恢復(fù)海馬的結(jié)構(gòu)和功能[11]。本研究證實(shí)了產(chǎn)前抑郁會(huì)對(duì)子代AHN的影響，反映在應(yīng)激孕鼠的子代AHN顯著降低。應(yīng)激孕鼠在補(bǔ)充DHA后，子代的AHN恢復(fù)接近正常小鼠。這提示DHA可減輕或修復(fù)胚胎因應(yīng)激引起的海馬發(fā)育損傷，其方式可能和增強(qiáng)海馬的神經(jīng)發(fā)生相關(guān)。

綜上所述，DHA可在應(yīng)激孕鼠模型中明顯改善子代小鼠的類抑郁行為以及認(rèn)知功能下降，其可能機(jī)制和DHA改善子鼠海馬神經(jīng)發(fā)生有關(guān)。首先，DHA不僅僅改善圍產(chǎn)期抑郁孕婦的抑郁行為，而且對(duì)于因抑郁引起子代的腦發(fā)育損傷導(dǎo)致抑郁行為也有顯著的改善作用。其次，之前的研究[12]發(fā)現(xiàn)抑郁孕鼠也會(huì)引起子代的抑郁行為，引起子代抑郁的原因很多，本研究發(fā)現(xiàn)子代抑郁行為可能和神經(jīng)發(fā)生降低有關(guān)。DHA作為神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要的分子，可改善因圍產(chǎn)期抑郁引起的子代腦部發(fā)育損傷。孕期補(bǔ)充DHA可以改善子鼠因海馬神經(jīng)發(fā)生，降低子代的抑郁行為。