方 穎，曹東升，謝 娟，呂 陽

傷口愈合是一個復雜的過程，它涉及多個細胞群、細胞外基質和可溶性介質，如生長因子和細胞因子[1]。如果正常的愈合過程被中斷，糖尿病潰瘍會由于缺乏生長因子和細胞因子而在本質上成為慢性潰瘍。糖尿病潰瘍傳統(tǒng)治療方法傷口愈合緩慢，治療時間長，治療成本高，給患者帶來痛苦。自體富血小板凝膠(autologous platelet-rich gel,APG)是一種生物活性化合物，自1985年問世以來，由于其具有激活和誘導細胞增殖和血管生成，加速傷口愈合的優(yōu)點，被廣泛運用于治療創(chuàng)面[2]。該研究通過制作兔糖尿病皮膚潰瘍動物模型，將富血小板凝膠應用于糖尿病兔潰瘍創(chuàng)面，觀察其療效，分析該方法的臨床效果和可行性，為臨床治療難治性糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗對象24只新西蘭雄性白兔，約3月齡，2.5～3 kg，在環(huán)境溫度為(22±2) ℃，濕度為(55±5)%的條件下，在安徽醫(yī)科大學動物實驗中心飼養(yǎng)。保持室內通風良好，實驗前預飼養(yǎng)1周使其適應環(huán)境。在整個實驗期間，兔子隨意喂食和水。

1.2 糖尿病兔模型及皮膚創(chuàng)面的建立

1.2.1糖尿病兔建模 將5 g四氧嘧啶(北京索萊寶科技有限公司)溶解在100 ml氯化鈉中，制備5%四氧嘧啶溶液。在每只兔子通過體重秤稱重后，立即通過無菌注射器取出試劑以120 mg/kg將其注射到耳靜脈中。然后按照一只一籠送回飼養(yǎng)籠，每日三餐予以正常喂養(yǎng)，每餐兔糧予以適當加量，正常飲水。每日上午空腹測血糖，直到血糖持續(xù)7 d高于11.0 mmol/L，表明糖尿病兔模型成功建立[3]。

1.2.2創(chuàng)面的形成 將糖尿病兔背部備皮，將直徑為2.5 cm的圓紙片放置于糖尿病兔脊柱兩側，分別用亞甲藍標記。稱重后，按3 ml/kg的注射劑量，用1%戊巴比妥鈉注入耳緣靜脈。麻醉效果滿意后固定于手術臺上，消毒鋪巾后，用剪刀片沿著標記線切開皮膚至筋膜層，完全去除皮膚層。創(chuàng)面出血點血管鉗夾閉止血，生理鹽水沖洗后無菌紗布加壓包扎固定，術后預防性使用青霉素鈉20萬單位肌肉注射。余下兔子重復上述操作。

1.3 APG的制備從糖尿病兔耳緣靜脈中取10 ml血液，放入管底已有1 ml枸櫞酸鉀的無菌離心管內，混合后，2 000 r/min離心4 min，并將上部血漿吸引至1 mm的紅細胞層。移至另一個無菌離心管中，4 000 r/min離心6 min，吸出3/4上清液棄去。搖動剩余的下層并富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)。將凝血酶1 000 U溶于10%氯化鈣注射液1 ml配置成凝血酶-鈣劑，使PRP和凝血酶鈣劑以10 ∶1比例混合，等待自然凝固后即可形成APG凝膠備用。見圖1。

圖1 APG的制備A：兔全血；B：一次離心后；C：APG凝膠；D：APG覆蓋創(chuàng)面

1.4 干預治療潰瘍創(chuàng)面形成之后將所有的實驗動物的背部脊柱左側創(chuàng)面標記為a，脊柱右側創(chuàng)面標記為b，a缺損用APG覆蓋治療，b缺損用無菌生理鹽水清洗后用0.5%的安多福常規(guī)換藥，用紗布和繃帶固定。

1.5 檢測指標

1.5.1創(chuàng)面面積 記錄所有傷口并在傷口形成時，干預后3、7、14 d用數(shù)碼相機編號。將圖片上傳至Image J圖片分析軟件中，得出每次創(chuàng)面的面積大小。

1.5.2免疫組織化學檢查 分別在干預治療后1周末、2周末取創(chuàng)面新鮮肉芽組織進行石蠟包埋，免疫組化標記血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,IGF)，VEGF染色及IGF染色陽性呈不同程度的棕色。采用光學顯微鏡拍照及 Image Plus Pro 6.0圖像分析系統(tǒng)測定VEGF及IGF含量。隨機選擇每個切片的4個高倍視野視圖，并測量它們各自的平均光密度并取平均值。

2 結果

2.1 大體觀察糖尿病兔成功建模后，水和尿量明顯增加，體質量下降，實驗動物全部存活。創(chuàng)面治療前，兩組創(chuàng)面大小基本相同；治療1周后，實驗組創(chuàng)面面積跟對照組相比明顯縮??；治療2周后，實驗組創(chuàng)面愈合率明顯高于對照組(圖2)。

圖2 創(chuàng)面形成后治療1周和2周時創(chuàng)面愈合情況

A：實驗組創(chuàng)面治療前；B:對照組創(chuàng)面治療前；C:APG治療1周；D:常規(guī)換藥治療1周；E、F:治療2周；a:APG組；b：對照組

2.2 創(chuàng)面面積及容積變化治療前創(chuàng)面大小無統(tǒng)計學意義；相比于空白對照組，APG組治療后的皮膚潰瘍面積減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。以3周末為終末觀察點，實驗組創(chuàng)面有23個愈合，愈合率為95.8%，對照組創(chuàng)面有11個愈合，愈合率為45.8%。

表1 治療前及治療后潰瘍面積變化

2.3 免疫組化VEGF、IGF平均光密度值在第1周末和第2個周末，通過免疫組化照片可以明顯看出APG組中VEGF和IGF的陽性率與空白對照組中的陽性率顯著不同，見圖3、4，實驗組的陽性率均高于對照組。在第1周末和第2周末，APG治療組中VEGF及IGF的平均光密度值與對照組中VEGF及IGF的平均光密度值相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

圖3 治療組及對照組VEGF免疫組化表達情況 ×400

A：第1周末APG組VRGF標記后；B:第1周末對照組VRGF標記后；C:第2周末APG組VRGF標記后；D:第2周末對照組VRGF標記后

圖4 治療組及對照組IGF免疫組化表達情況 ×400

A：1周末APG組IGF標記后；B:1周末對照組IGF標記后；C:2周末APG組IGF標記后；D:2周末對照組IGF標記后

表2 各組創(chuàng)面組織不同時間的VEGF及IGF的

3 討論

在本研究中，APG被用作糖尿病潰瘍的非侵入性治療方法，應用于糖尿病兔潰瘍創(chuàng)面中并且獲得了良好的結果。一般傷口愈合包括止血、炎癥、增殖和重塑四個過程[4]，然而糖尿病潰瘍的愈合過程并未遵循。糖尿病潰瘍正常的愈合過程經(jīng)常被中斷，導致傷口在一個或多個上述愈合階段停滯[5]。由于缺乏生長因子和細胞因子，潰瘍可能變成慢性、延緩愈合過程[6]。

血液不僅僅是向各種細胞和器官輸送氧氣和營養(yǎng)，也是一個具有相互作用的細胞和基質的完整組織。在凝血過程中，該組織僅在受傷部位以固體形式聚集和穩(wěn)定自身。血小板濃縮物通常是天然血凝塊的人工版本，它們也應該模擬凝血的內在功能，創(chuàng)建組織再生的指導基質[7]。因此，血小板濃縮物應被視為組織，而不是藥物佐劑，對這些生物材料特性的評估與凝血和愈合本身的研究一樣復雜。與所有組織一樣，血小板濃縮物聚集了許多協(xié)同作用的成分，參與愈合過程。

本實驗在第1周末及第2周末分別取兔子新生肉芽組織及皮膚進行免疫組化標記VEGF及IGF，APG組蛋白平均光密度均高于對照組。VEGF是血管生成的中介，其刺激內皮細胞增殖并且還是血管生成的有效誘導物，其影響內皮細胞的增殖和遷移[8]。IGF由血小板大量釋放，在血液中以循環(huán)形式存在,這一因素不僅在傷口愈合和凝血過程中很重要，而且是當前生物體生存的中介，其功能依賴于局部情況，對細胞增殖分化有積極影響，但主要是誘導存活信號，保護細胞免受各種凋亡刺激[9]。

作為局部敷料，APG的作用是為傷口愈合提供所需的生長因子[10]，愈合的初始階段由血小板分泌的生長因子介導。血小板由凝血酶激活，凝血酶是一種促進傷口愈合的天然血小板活化劑。利用凝血酶-鈣劑來激活血小板，在生長因子釋放和促進凝膠形成方面取得了良好的效果。此外，使用凝血酶-鈣劑也帶來了一些實際的好處，使制備凝膠形成的時間更短，重現(xiàn)性更高。Anitua et al[11]在血小板活化后24 h內觀察到生長因子釋放的動力學。通過掃描電子顯微鏡(SEM)發(fā)現(xiàn)生長因子釋放有顯著的高水平，這些高水平可以歸因于凝血酶-鈣劑和氮循環(huán)的差異，氮循環(huán)用于溶解血塊并釋放血塊內的所有生長因子，從而增加濃度。葡萄糖酸鈣的加入促進了天然凝血酶的逐漸形成，它模仿了生理凝血過程，使生長因子持續(xù)釋放[12]。APG促進基質的合成和沉積，促進纖維肉芽組織的形成，改善膠原合成，并在創(chuàng)傷后上皮再生、間質增生和新血管形成中起重要作用。

本實驗將自體血小板凝膠治療糖尿病兔創(chuàng)面取得了良好的療效，為以后臨床廣泛應用自體血小板凝膠提供動物試驗依據(jù)及理論基礎。