馬 旸，崔東倩，韓陳陳，羅婷婷，魏 偉

肝癌是常見的惡性腫瘤，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占原發(fā)性肝癌的85%以上，預(yù)后不良，5年總生存率小于12%[1]。研究[2]表明其預(yù)后不良與HCC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此亟需確定介導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-l, IGF-1)在許多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展，通過作用在其受體——胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R)參與轉(zhuǎn)導(dǎo)多種信號(hào)途徑如JNK、MAPK、PI3K/Akt途徑發(fā)揮作用[3]。MCF-7細(xì)胞中IGF-1通過PI3K/Akt信號(hào)通路依賴的方式升高附膜蛋白的表達(dá)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[4]；此外，IGF-1可以通過上調(diào)組織蛋白酶B的表達(dá)促進(jìn)HCC細(xì)胞系的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5]。早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1(early growth response protein 1, EGR1)是一個(gè)分子量為82 ku的轉(zhuǎn)錄因子，屬于即刻早期基因簇中的一員，有絲分裂刺激包括血清，非致死性應(yīng)激，例如輻射和缺氧，均可激活EGR1表達(dá)[6]。一旦激活，EGR1與血清響應(yīng)因子形成復(fù)合物與富含GC的區(qū)域結(jié)合，控制下游多個(gè)基因的表達(dá)，如細(xì)胞因子TGF-β1、PDGF-A和PDGF-B和bFGF，這些因子被認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要意義[7]。

雖然IGF-1和EGR1都可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但它們?cè)诠餐{(diào)節(jié)HCC的遷移侵襲中的作用和機(jī)制尚未發(fā)現(xiàn)。本研究中，選用兩株HCC細(xì)胞株，加入不同濃度的IGF-1刺激細(xì)胞，用transwell的方法檢測(cè)了細(xì)胞的遷移和侵襲情況，為了探究其分子機(jī)制，利用Western blot和RT-PCR方法檢測(cè)了胞內(nèi)Akt及ERK信號(hào)通路的活化情況及EGR1的表達(dá)，進(jìn)一步利用siRNA的方法將EGR1的表達(dá)水平敲低，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遷移和侵襲的功能檢測(cè)。本研究旨在揭示HCC細(xì)胞中IGF-1調(diào)控EGR1的作用，為闡明IGF-1調(diào)節(jié)HCC遷移侵襲的新機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑和抗體 EGR1、磷酸化p44/42 MAPK(ERK1/2)的抗體(Thr202 / Tyr204)、p44/42 MAPK(ERK1/2)、磷酸化Akt(Ser473)、Akt、磷酸化IGF1R β(Tyr1135)、IGF1Rβ購自美國Cell Signaling Technology公司；人重組IGF-1來自美國Peprotech公司；SP1、β-actin抗體購美國Santa Cruz 公司；HRP偶聯(lián)抗兔、小鼠、山羊IgG購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.2細(xì)胞株的使用和培養(yǎng) 人源HCC細(xì)胞系HepG2購自美國ATCC細(xì)胞庫；HCCLM3購自復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所，并保持在DMEM加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和2 nmol/LL-谷氨酰胺和青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)基里，將細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1Transwell法測(cè)定細(xì)胞遷移和侵襲 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且無血清處理12～24 h的HepG2或HCCLM3細(xì)胞，經(jīng)消化離心后，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸計(jì)數(shù)，在含有8 μm孔徑的聚碳酸酯纖維膜的24孔板中接種細(xì)胞，每個(gè)內(nèi)室加入200 μl含不同濃度IGF-1的細(xì)胞懸液，每孔均含5×104個(gè)細(xì)胞。于24孔板即外室中加入700 μl的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，避免有氣泡產(chǎn)生，進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，在侵襲實(shí)驗(yàn)中，將Matrigel混合DMEM(4 ∶3)放于內(nèi)室，使細(xì)胞在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出小室，90%乙醇固定10 min，用PBS溶液濕潤的棉簽輕輕擦去上室表面未侵襲的細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染液室溫下染色10 min。PBS漂去多余染料，顯微鏡下每孔隨機(jī)取5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)并求平均值。

1.2.2Western blot 用RIPA裂解緩沖液裂解HepG2或HCCLM3細(xì)胞株，裂解物在4 ℃、13 000 r/min下離心15 min。將可溶性蛋白質(zhì)在SDS中變性，在其上分離12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并與封閉緩沖液(5%脫脂奶粉的TBST)一起孵育4 ℃過夜。免疫印跡分別用一抗(1 ∶1 000)和二抗HRP-山羊抗兔抗體(1 ∶15 000)與PVDF膜進(jìn)行孵育，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3RT-PCR和定量實(shí)時(shí)PCR 按照TRIzol試劑說明書的方法提取細(xì)胞總RNA，使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，以下的引物用于RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。β-actin-Fw:5′-GAC CTG ACT GAC TAC CTC ATG AAG AT-3′;β-actin-Re:5′-GTC ACA CTT CAT GAT GGA GTT GAA GG-3′;EGR1-Fw:5′-CTG ACC GCA GAG TCT TTT CCT G-3′;EGR1-Re:5′-TGG GTG CCG CTG AGT AAA TG-3′。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1增強(qiáng)HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力為了確定IGF-1對(duì)HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，將不同濃度的IGF-1加入HCC細(xì)胞株中，用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲的作用。結(jié)果表明，25、50和100 ng/ml的IGF-1可以不同程度地增加HepG2細(xì)胞遷移的穿膜數(shù)目(圖1A)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與空白組(182.6±3.0)比較，IGF-1刺激各組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增多(285.3±10.0, 395.0±5.0, 547.3±23.1)，且具有濃度依賴性的特征(F=437.1,P<0.05)(圖1B)，HepG2細(xì)胞侵襲的穿膜數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與空白組(170.6±9.0)比較，IGF-1刺激各組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增多(258.7±15.5, 369.7±13.8, 506.7±13.9)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=358.9,P<0.05)(圖1B)；HCCLM3細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組(155.0±5.0)比較，IGF-1刺激各組可濃度依賴地增加細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)(268.7±15.1, 402.3±8.7, 625.7±36.8)(F=290.9,P<0.05)(圖1C、1D)，HCCLM3細(xì)胞侵襲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組(168.3±17.5)比較，IGF-1刺激各組可濃度依賴地增加細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)(223.0±27.1, 425.0±27.8, 595.7±20.6)(F=205.3,P<0.05)(圖1C、1D)。以上結(jié)果表明，IGF-1可增強(qiáng)HepG2和HCCLM3的遷移和侵襲能力。

2.2 IGF-1對(duì)EGR1表達(dá)的影響在IGF-1刺激HCC細(xì)胞株4 h時(shí)收集細(xì)胞，利用Western blot、RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)胞內(nèi)Akt及ERK的活化及EGR1的表達(dá)，結(jié)果表明，不同濃度的IGF-1均可增加HCC細(xì)胞株中IGF1R、 AKT及ERK的磷酸化水平而對(duì)總表達(dá)無明顯改變，同時(shí)EGR1的蛋白表達(dá)也隨著IGF-1的濃度增高而增加(圖2A)，其mRNA水平也在IGF-1刺激下隨濃度相應(yīng)增加(圖2B)，與未刺激組比較，EGR1的mRNA水平顯著增加(圖2C)(FHepG2=578.2,FHCCLM3=325.6,P<0.01)，以上結(jié)果表明，IGF-1可促進(jìn)HepG2和HCCLM3胞內(nèi)Akt及ERK的活化，增加EGR1的mRNA及蛋白表達(dá)。

2.3 敲低EGR1的表達(dá)降低IGF-1誘導(dǎo)的HCC遷移和侵襲能力將EGR1 siRNA分別轉(zhuǎn)染至兩株HCC細(xì)胞系中，首先用Western blot、RT-PCR方法檢測(cè)EGR1的敲低效率，結(jié)果表明，HepG2和HCCLM3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA后，EGR1的蛋白和mRNA水平明顯減少(圖3A、3B)，在此基礎(chǔ)上加入50 ng/ml IGF-1，檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲作用。HepG2細(xì)胞遷移結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，IGF-1可顯著增加HepG2細(xì)胞的遷移，而沉默EGR1表達(dá)后，IGF-1刺激的細(xì)胞穿膜數(shù)目明顯減少(F=409.5,P<0.01)，HepG2細(xì)胞侵襲結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，IGF-1可顯著增加HepG2細(xì)胞的侵襲，而沉默EGR1表達(dá)后，IGF-1刺激的細(xì)胞穿膜數(shù)目明顯減少(F=138.8,P<0.01)(圖3C、3D)；HCCLM3細(xì)胞遷移結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，IGF-1可顯著增加HepG2細(xì)胞的遷移，而沉默EGR1表達(dá)后，IGF-1刺激的細(xì)胞穿膜數(shù)目明顯減少(F= 131.6,P<0.05)，HCCLM3細(xì)胞侵襲結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，IGF-1可顯著增加HepG2細(xì)胞的侵襲，而沉默EGR1表達(dá)后，IGF-1(228.0±21.5)刺激的細(xì)胞穿膜數(shù)目明顯減少(F= 51.7,P<0.05)(圖3E、3F)，以上結(jié)果顯示，抑制EGR1的表達(dá)降低IGF-1誘導(dǎo)的HepG2和HCCLM3細(xì)胞的遷移和侵襲能力，提示EGR1在介導(dǎo)IGF-1誘導(dǎo)的HCC遷移侵襲能力中發(fā)揮重要作用。

圖1 IGF-1增強(qiáng)HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力 ×100

A：Transwell法檢測(cè)IGF-1對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；B:IGF-1對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；C:Transwell法檢測(cè)IGF-1對(duì)HCCLM3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；D:IGF-1對(duì)HCCLM3細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；1:空白組；2：IGF-1 25 ng/ml組；3:IGF-1 50 ng/ml組；4:IGF-1 100 ng/ml組；與空白組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖2 IGF-1對(duì)Akt及ERK信號(hào)通路活化及EGR1表達(dá)的影響

A：Western blot方法檢測(cè)不同濃度IGF-1刺激下胞內(nèi)Akt及ERK信號(hào)通路的活化及EGR1的表達(dá)；B：RT-PCR檢測(cè)IGF-1刺激下EGR1的mRNA表達(dá)；C：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IGF-1刺激下EGR1的mRNA表達(dá)；1：HepG2；2：HCCLM3；與IGF-1 0 ng/ml組比較：**P<0.01

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力，IGF-1在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用在很多文獻(xiàn)中均有報(bào)道：IGF-1通過PI3K / PTEN / Akt / NF-кB信號(hào)通路影響胰腺癌細(xì)胞侵襲[8]； IGF-1與TGF-β聯(lián)合作用可激活金屬蛋白酶活性，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生[9]；IGF-1通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)增加survivin的表達(dá)，增加前列腺癌和結(jié)腸癌EMT的發(fā)生[10-11]。 但是，IGF-1與EGR1在HCC遷移和侵襲中的關(guān)系尚不清楚。

EGR1在肝細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用，但是其在HCC中的表達(dá)及效應(yīng)存在爭(zhēng)議：一項(xiàng)研究顯示EGR1在HCC中過表達(dá)[12]，而另一個(gè)發(fā)現(xiàn)HCC中EGR1表達(dá)下調(diào)[13]。最近研究數(shù)據(jù)表明EGR1在HCC中的不同生物學(xué)功能可能由其上游信號(hào)通路的激活有關(guān)，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)/c-Met信號(hào)[14]或IGF1R信號(hào)通路[15]，研究表明EGR1是介導(dǎo)HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移、侵襲功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其可以通過轉(zhuǎn)錄激活下游基因如MMP-2和MMP-9的表達(dá)而調(diào)控細(xì)胞功能[14]；此外，在以往研究[15]中也發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3(insulin-like growth factor-binding protein-3, IGFBP-3)通過抑制IGF-1誘導(dǎo)IGF1R信號(hào)通路，包括抑制Akt和ERK激活，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子EGR1的抑制，從而導(dǎo)致其靶基因bFGF和PDGF的分泌降低，使HCC細(xì)胞的增殖減弱。

圖3 敲低EGR1的表達(dá)降低IGF-1誘導(dǎo)的HCC遷移和侵襲能力 ×100

A、B:EGR1的siRNA分別轉(zhuǎn)染至HepG2和HCCLM3細(xì)胞中，Western blot、RT-PCR方法檢測(cè)EGR1的敲低效率；C、D：沉默EGR1表達(dá)后，transwell法檢測(cè)IGF-1刺激的HepG2細(xì)胞遷移和侵襲及其數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖；E、F：沉默EGR1表達(dá)后，transwell法檢測(cè)IGF-1刺激的HCCLM3細(xì)胞遷移和侵襲及其數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖；1：si-scramble組；2：si-EGR1組；3:si-scramble+ IGF-1組；4:si-EGR1+ IGF-1組；與si-scramble組比較：**P<0.01；與si-scramble+ IGF-1組比較：##P<0.01

本研究選用兩株不同轉(zhuǎn)移特性的HCC細(xì)胞株HepG2和HCCLM3，利用不同濃度的IGF-1刺激細(xì)胞，用transwell的方法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲情況，結(jié)果表明IGF-1可濃度依賴的增加HCC的遷移侵襲能力；為了探究其分子機(jī)制，利用Western blot和RT-PCR方法檢測(cè)胞內(nèi)Akt及ERK信號(hào)通路的活化情況及EGR1的表達(dá)，結(jié)果表明IGF-1可活化HCC中Akt及ERK信號(hào)通路，增加EGR1的蛋白及mRNA表達(dá)，進(jìn)一步利用siRNA的方法將EGR1的表達(dá)水平敲低，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遷移和侵襲的功能檢測(cè)，結(jié)果表明敲低EGR1水平可降低IGF-1誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞侵襲遷移。

綜上，本研究初步揭示在HCC細(xì)胞株中IGF-1可活化Akt及ERK信號(hào)通路和增加EGR1的表達(dá)，介導(dǎo)HCC的遷移和侵襲，將為揭示HCC遷移和侵襲的新機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。