竇懷乾， 李仰平, 呂 佳， 竇錦壯， 李語(yǔ)麗， 王 師,2**

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2.海洋生物學(xué)與技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)于1980年代初由日本引入中國(guó)[1]，并在山東、遼寧等北方沿海地區(qū)進(jìn)行大規(guī)模人工養(yǎng)殖。目前已在渤海及黃海北部形成規(guī)模化和產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖，成為中國(guó)北方最重要的海水養(yǎng)殖貝類(lèi)之一[2]。

近幾年，隨著二代高通量測(cè)序技術(shù)(Next generation sequencing, NGS)技術(shù)快速的發(fā)展，組學(xué)研究成為了當(dāng)前的熱點(diǎn)。目前，利用高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)完成了許多海洋軟體動(dòng)物基因組的測(cè)序和拼接，例如：馬氏珠母貝(Pinctadafucata)[3]、太平洋牡蠣(Crassostreagigas)[4]、帽貝(Lottiagigantea)[5]、章魚(yú)(Octopusbimaculoides)[6]、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[7]等。在基因組拼接的過(guò)程中，物理圖譜是一個(gè)最重要的輔助完成全基因組拼接，提高基因組拼接水平的工具之一。物理圖譜基于逐步克隆(Clone-by-clone)的策略[8]獲得各個(gè)克隆的相對(duì)位置；其與基因組草圖結(jié)合，能對(duì)基因組中的重復(fù)序列和拼接斷點(diǎn)等區(qū)段進(jìn)行修正和連接，不僅能顯著提升拼接的效果，更能對(duì)拼接得到的基因組進(jìn)行校正。

利用Fosmid大片段文庫(kù)已完成多個(gè)物種物理圖譜的構(gòu)建，如：人(Homosapiens)[9]、大猩猩(Gorillagorilla)[10]、水稻(Oryzasativa)[11]、長(zhǎng)臂猿(Nomascusleucogenys)[12]、甜菜(Betavulgaris)[13]等。這種方法在海洋生物中也有廣泛的應(yīng)用，例如海鞘(Botryllusschlosseri)[14]，半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[15]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[16]，櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[17]等。構(gòu)建物理圖譜的方法有SNaPshot技術(shù)[18]、BioNano[19]、OpticalMap[20]、WGP技術(shù)等[21]，而WGP (Whole genome profiling，全基因組解析)物理圖譜是一種基于大片段克隆文庫(kù)混池策略及克隆特異序列標(biāo)簽的新型物理圖譜構(gòu)建方法。它利用克隆間標(biāo)簽序列的特異性來(lái)確定克隆的重疊關(guān)系，排除了DNA指紋技術(shù)酶切條帶大小差異產(chǎn)生的誤差，提高了精度和可靠性；與高通量測(cè)序結(jié)合，不需要對(duì)酶切片段進(jìn)行電泳，極大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作步驟。利用WGP法，van Oeveren等完成了擬南芥(Arabidopsisthaliana)物理圖譜[21]的構(gòu)建。以擬南芥BAC文庫(kù)6 144個(gè)克隆為材料，采用EcoRI/MseI兩種限制性?xún)?nèi)切酶獲取標(biāo)簽，最終解碼4 599個(gè)克隆，克隆解碼率為74.8%；構(gòu)建完成的物理圖譜實(shí)現(xiàn)了98%的標(biāo)簽準(zhǔn)確排序，覆蓋了97%的基因組。Nicolas Sierro等利用WGP法構(gòu)建了煙草的物理圖譜[22]，對(duì)425 088個(gè)BAC克隆，采用EcoRI/MseI兩種限制性?xún)?nèi)切酶獲取標(biāo)簽，成功解碼361 034個(gè)，解碼率84.9%。

在利用WGP法進(jìn)行物理圖譜構(gòu)建時(shí)，實(shí)驗(yàn)中的克隆混池策略，即多少?gòu)埌?克隆)混合在一起，是物理圖譜構(gòu)建的關(guān)鍵。在選定的混合尺度下，既需要控制混合的克隆數(shù)目，保證能夠獲得高克隆解碼率，又需要能盡可能多的混合克隆，來(lái)平衡測(cè)序的成本。因此，在進(jìn)行WGP法物理圖譜構(gòu)建之前，對(duì)克隆混池策略及解碼率進(jìn)行研究，就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)室于近期完成了蝦夷扇貝基因組圖譜[7]的繪制工作，但基因組的高復(fù)雜度及高重復(fù)序列含量，使得某些區(qū)段會(huì)產(chǎn)生拼接的錯(cuò)誤，物理圖譜便可以對(duì)這些錯(cuò)誤的拼接進(jìn)行校正[23]。因此本研究基于構(gòu)建完成的蝦夷扇貝Fosmid大片段文庫(kù)，對(duì)4、8、12、16張384孔培養(yǎng)板混合尺度下Fosmid克隆解碼率進(jìn)行了分析，為后期采用WGP法構(gòu)建蝦夷扇貝物理圖譜提供了混池和解碼方案的參考。

1 材料與方法

1.1 Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料為新鮮蝦夷扇貝活體解剖后，保存于-80 ℃超低溫冰箱的肉柱(橫紋肌)。試劑盒為Epicentre CopyControlTMFosmid 文庫(kù)構(gòu)建試劑盒。

1.1.2 蝦夷扇貝基因組DNA的提取及末端修復(fù) 蝦夷扇貝的DNA采用酚/氯仿抽提法提取，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，并利用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀(NanoVue spectrophotometer, General Electric)檢測(cè)A260/A280、A260/A230以及DNA濃度，確保樣品合格。然后對(duì)基因組DNA進(jìn)行末端修復(fù)，以保證片段和載體連接效率。反應(yīng)的組分如下：20 μg DNA x μL，End-Repair 10×Buffer 8 μL，0.25 mol/L dNTPs 8 μL，1 mmol/L ATP 8 μL，End-Repair Enzyme Mix 4 μL，ddH2O (52-x) μL。22 ℃恒溫45 min，加入Loading Buffer后，70 ℃，滅活10 min。

1.1.3 目的片段回收及目的片段與載體連接 末端修復(fù)的產(chǎn)物，經(jīng)脈沖場(chǎng)凝膠電泳進(jìn)行目的片段的回收，具體方法如下：采用線(xiàn)性自動(dòng)程序，20～60 kb輸入片段大小，0.5×TBE電泳液，電泳16 h；EB染色10 min，根據(jù)Marker位置，切取40 kb大小的目的片段，經(jīng)Epicentre CopyControlTMFosmid試劑盒進(jìn)行目的片段的回收；然后將目的片段和試劑盒中提供的載體(CopyControl pCC1FOSTM)進(jìn)行連接。

連接反應(yīng)10 μL，體系如下：0.25 μg插入片段6 μL，10×Fast-Link連接緩沖液1 μL，10 mmol/L ATP 1 μL，pCC1FOS 載體(0.5 μg/μL)1 μL，F(xiàn)ast-Link DNA連接酶(試劑盒內(nèi)置)1 μL。置于PCR儀(Bio-Rad)，22 ℃恒溫2 h；70 ℃滅活10 min。

1.1.4 質(zhì)粒包裝與噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo) 將連接產(chǎn)物與試劑盒中的MaxPlax Lambda Packaging Extracts包裝蛋白進(jìn)行包裝，每次25 μL，連續(xù)包裝2次。待包裝完成之后，補(bǔ)加25 μL氯仿和940 μL噬菌體稀釋緩沖液(PDB)混勻，然后取10 μL混合樣與提前準(zhǔn)備好的A600在0.8～1.0的宿主菌(試劑盒提供)100 μL進(jìn)行噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)，可同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)多個(gè)樣品。

1.1.5 克隆的培養(yǎng)及獲取 將多個(gè)上述110 μL混合體系分別涂布到LB固體平板(氯霉素12.5 μg/mL)進(jìn)行克隆培養(yǎng)。在克隆生長(zhǎng)到合適大小，利用滅菌牙簽將克隆逐一挑取到無(wú)菌且添加了400 μL(氯霉素12.5 μg/mL)液態(tài)LB的96孔深孔板中。37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后添加甘油，至終濃度為20%，混勻之后轉(zhuǎn)移到384孔板中保存。至此，即完成蝦夷扇貝Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建。

1.2 數(shù)據(jù)的模擬分析

在WGP測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建之前，以實(shí)驗(yàn)室的蝦夷扇貝基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行混合克隆數(shù)目的模擬。具體方式如下：蝦夷扇貝基因組大小約1 Gb，用BsaXI和FspEI兩種酶進(jìn)行酶切；從基因組中隨機(jī)獲得384N(N=1,2…24)個(gè)40 kb片段，一個(gè)片段即代表一個(gè)克隆，模擬克隆在384孔培養(yǎng)板中的分布分別進(jìn)行行池、列池、板池的編號(hào)；獲得相應(yīng)倍數(shù)下，片段內(nèi)的BsaXI和FspEI兩種酶酶切標(biāo)簽總和，并統(tǒng)計(jì)標(biāo)簽唯一位置出現(xiàn)的概率，獲得混池策略的模擬結(jié)果。

在具體的實(shí)驗(yàn)中，需要在384培養(yǎng)板混合數(shù)目和解碼率兩者之間進(jìn)行取舍。更少的板數(shù)混合會(huì)獲得更高的解碼率，但實(shí)驗(yàn)通量較小，單一混合樣本包含的克隆數(shù)目較少，為了獲得特定的覆蓋度，測(cè)序的成本會(huì)增加。反之，更多的板數(shù)混合雖然會(huì)帶來(lái)解碼率的降低，但能在單一樣本的測(cè)序中包含更多的克隆數(shù)目，降低測(cè)序的成本。所以實(shí)驗(yàn)中需要選擇合適的混合尺度來(lái)平衡解碼率和混合尺度相關(guān)連的測(cè)序成本。

1.3 WGP測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建

1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料為構(gòu)建完成的蝦夷扇貝Fosmid文庫(kù)克?。罕４嬗?80 ℃超低溫冰箱，共計(jì)320張384孔培養(yǎng)板，122 880個(gè)克隆。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，挑取384孔板中的克隆置于96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行活化。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)超級(jí)池，行池，列池的界定如下。以8張為例：超級(jí)池：8 張 384 孔培養(yǎng)板的克隆。二級(jí)池：8 張 384 孔培養(yǎng)板疊在一起的行和列的克隆，稱(chēng)行池和列池(16行24列)。板池：每張 384 孔培養(yǎng)板對(duì)應(yīng)的克隆。這樣每 8 張 384 孔培養(yǎng)板中，就包括了 1 個(gè)超級(jí)池，16 個(gè)行池，24 個(gè)列池，8 個(gè)板池，共 49 個(gè)池。該研究構(gòu)建了4、8、12、16張384 孔培養(yǎng)板為單位的4個(gè)混合尺度共200個(gè)池。

1.3.2 質(zhì)粒提取 用堿裂解法[24]提取通過(guò)混合克隆獲得的每個(gè)行池、列池、板池的質(zhì)粒DNA(共200個(gè)樣品)，使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA完整性，并利用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀檢測(cè)A260/A280、A260/A230以及DNA濃度，確保樣品合格。然后統(tǒng)一稀釋至200 ng/μL，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3 2b-RAD測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建 將提取的Fosmid克隆質(zhì)粒進(jìn)行2b-RAD測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建[25]。本研究采用了限制型內(nèi)切酶BsaXI，和修飾依賴(lài)型內(nèi)切酶FspEI兩種酶，進(jìn)行固定標(biāo)簽長(zhǎng)度的2b-RAD型文庫(kù)的構(gòu)建。

(1) 限制性?xún)?nèi)切酶酶切

BsaXI(New England Biolabs)酶切體系15 μL，組成如下：質(zhì)粒DNA 1 μL，Buffer 4 1.5 μL，BsaXI 2 μL，ddH2O 11.5 μL。設(shè)置酶切反應(yīng)空白對(duì)照組，內(nèi)切酶用同等體積 ddH2O 替代,其余組分同實(shí)驗(yàn)組一致。37 ℃恒溫孵育3 h。取2 μL樣品，1%瓊脂糖檢測(cè)DNA條帶是否被切開(kāi)。

FspEI酶在酶切之前，需要利用M.SssI酶對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行預(yù)處理，使其所有CG位點(diǎn)全部轉(zhuǎn)化成可被FspEI識(shí)別的甲基化酶切位點(diǎn)。具體反應(yīng)體如下：M.SssI(New England Biolabs)反應(yīng)體系20 μL，組成如下：質(zhì)粒DNA 1 μL，10×Buffer-2 2 μL，10×SAM 2 μL，M.SssI 1 μL，ddH2O 14 μL。37 ℃恒溫孵育1 h，65 ℃滅活20 min。

FspEI(New England Biolabs)酶切體系30μL，組成如下：M.SssI處理產(chǎn)物10 μL，10×CutSmart Buffer 3 μL，30×Enzyme Activator Solution 1 μL，F(xiàn)spEI 1 μL，ddH2O 15 μL。設(shè)置酶切反應(yīng)空白對(duì)照組，內(nèi)切酶用同等體積 ddH2O 替代，其余組分同實(shí)驗(yàn)組一致。37 ℃恒溫3 h, 80 ℃滅活20 min。取2 μL樣品，1%瓊脂糖檢測(cè)DNA條帶是否被切開(kāi)。

(2) 接頭連接

利用T4 DNA連接酶在BsaXI酶切標(biāo)簽兩端連接Illumina 測(cè)序平臺(tái)特異接頭Ad1(Slx-MpAd1-NNN)和Ad2(Slx-MpAd2-NNN)[25]；而FspEI標(biāo)簽兩端連接的接頭為Ad1(Slx-MpAd1-NNNN)和Ad2(Slx-MpAd2-NNNN)。

T4連接反應(yīng)體系22 μL，組成如下：酶切產(chǎn)物DNA 10 μL，ATP (10 mmol/L) 2 μL，Ad1(5 μmol/L) 0.8 μL，Ad2(5 μmol/L) 0.8 μL，T4 ligase buffer 2.2 μL，T4 ligase 2 μL。4 ℃恒溫過(guò)夜。

(3) 1stPCR擴(kuò)增

用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)和Illumina測(cè)序平臺(tái)特定引物1stP1(Slx-1st-MpPrimer-1) 和1stP2(Slx-1st-MpPrimer-2)對(duì)連接過(guò)接頭的標(biāo)簽進(jìn)行一輪PCR擴(kuò)增，來(lái)增加標(biāo)簽的數(shù)目。

1stPCR擴(kuò)增體系20 μL，組成如下：連接產(chǎn)物7 μL，5×H buffer 4 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.6 μL，1stP1(10 mmol/L)0.4 μL，1stP2(10 mmol/L) 0.4 μL，Phusion DNA Polymerases 0.2 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR條件如下：(98 ℃ 5 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 10 s)，14個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

(4) 1stPCR產(chǎn)物回收

1stPCR產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠300 V/60 min電泳后，回收約100 bp的目標(biāo)片段。充分研磨膠塊，加入40 μL ddH2O，4 ℃透析過(guò)夜。天根CA2柱過(guò)濾回收獲得1stPCR產(chǎn)物。

(5) 2ndPCR擴(kuò)增

提純后的1stPCR產(chǎn)物與二輪擴(kuò)增引物 2ndP1(Slx-2nd-MpPrimer)和2ndP2(Slx-index-Barcode進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，用來(lái)引入Barcode序列。(2ndP2中含有一段Barcode序列，能夠在平行測(cè)序中區(qū)分來(lái)自不同樣品的標(biāo)簽)。

2ndPCR擴(kuò)增體系20 μL，組成如下：1stPCR產(chǎn)物3 μL，5×H buffer 4 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.6 μL，2ndP1(10 mmol/L) 0.2 μL，2ndP2(10 mmol/L) 0.2 μL，Phusion DNA Polymerases 0.2 μL，ddH2O 11.8 μL。PCR條件如下：(98 ℃ 5 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 10 s)，7個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

(6)產(chǎn)物純化

采用QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) 純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，35 μL的ddH2O洗脫DNA。

(7)文庫(kù)測(cè)序

構(gòu)建完成的2b-RAD測(cè)序文庫(kù)，采用Illumina HiSeq 2000 平臺(tái)進(jìn)行單末端測(cè)序(36SE)。

1.3.4 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析 測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)利用本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的RADtyping[26]軟件進(jìn)行分析，詳細(xì)步驟如下：

(1)質(zhì)量過(guò)濾：將原始測(cè)序文件中，含N及堿基平均質(zhì)量低于30的序列去除。

(2)文庫(kù)劃分：根據(jù)序列中添加的Barcode(2ndP2)，將來(lái)自相同行池，列池的標(biāo)簽分到一起。

(3)提取BsaXI和FspEI標(biāo)簽：根據(jù)兩種酶的酶切位點(diǎn)提取酶切標(biāo)簽。

(4)去除污染標(biāo)簽：將提取到的酶切標(biāo)簽分別與宿主細(xì)菌基因組序列和載體序列比對(duì)，并去除比對(duì)上的污染標(biāo)簽。

(5)標(biāo)簽聚類(lèi)：對(duì)得到的標(biāo)簽無(wú)錯(cuò)配的聚類(lèi)，只保留出現(xiàn)大于等于2次的標(biāo)簽，去除可能測(cè)序錯(cuò)誤數(shù)據(jù)。

(6) 解碼克?。焊鶕?jù)1.3.1中的混池策略，解碼標(biāo)簽(克隆)。解碼規(guī)則如下：a在對(duì)應(yīng)的行池、列池、板池中，只出現(xiàn)一次的標(biāo)簽，意味著它在三維坐標(biāo)中擁有唯一的點(diǎn)，能夠定位到單個(gè)克隆。標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的克隆即為解碼出的克隆，這樣克隆能夠用于重疊群的建立。b在行、列、板三種池中都出現(xiàn)，但二級(jí)池出現(xiàn)多次的標(biāo)簽，能夠定位到多個(gè)克隆。c只出現(xiàn)在1種或2種二級(jí)池的標(biāo)簽，無(wú)法定位到克隆。定位到多個(gè)克隆及無(wú)法定位到克隆的標(biāo)簽，都無(wú)法用于后續(xù)克隆重疊群的建立。

通過(guò)上述解碼分析，統(tǒng)計(jì)解碼出的克隆個(gè)數(shù)，獲得解碼率。并統(tǒng)計(jì)每個(gè)超級(jí)池中單個(gè)克隆解出的標(biāo)簽數(shù)及標(biāo)簽測(cè)序深度結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Fosmid文庫(kù)構(gòu)建

2.1.1 目的片段的回收 在文庫(kù)的構(gòu)建中，目的片段的回收至關(guān)重要，回收片段的質(zhì)量決定了后期連接的效率。該實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)獲得的目的DNA具有很高的片段一致性(見(jiàn)圖1)。

2.1.2 轉(zhuǎn)導(dǎo)效果 10 μL包裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)涂板后，每張平板(直徑15 cm)一般可形成約1 000個(gè)克隆左右，效價(jià)為1×105cfu/mL。圖2所示為包裝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果圖，克隆數(shù)目較多，大小較為一致，轉(zhuǎn)導(dǎo)效果好良好。

2.2 WGP測(cè)序文庫(kù)的分析

2.2.1 模擬數(shù)據(jù)結(jié)果分析 混合克隆數(shù)目的數(shù)據(jù)模擬分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著混合的384孔板的數(shù)目的增加，即克隆數(shù)目的增加，解碼率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。BsaXI對(duì)應(yīng)的解碼率從最開(kāi)始的99.74%下降到85.66%，F(xiàn)spEI對(duì)應(yīng)的解碼率從最開(kāi)始的99.48%下降到93.29%，前者比后者下降的幅度更大。

(M1：λ DNAHindIII digest；M2：42 kb Fosmid control DNA；1～2：切膠回收的目的DNA片段。M1:λ DNAHindIII digest; M2:42 kb Fosmid control DNA; 1～2: DNA fragments.)

圖1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳檢測(cè)切膠回收DNA片段

Fig.1 DNA fragments detection with Pulse field gel electrophoresis

圖2 噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)克隆培養(yǎng)結(jié)果圖

圖3 超級(jí)池構(gòu)建策略的模擬結(jié)果

綜合模擬數(shù)據(jù)的結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)成本的因素，最終挑選了模擬混合尺度中的4、8、12、16這4個(gè)混合尺度去進(jìn)行實(shí)驗(yàn)部分的超級(jí)池及對(duì)應(yīng)測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。

2.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 本研究中以BsaXI和FspEI兩種限制性?xún)?nèi)切酶構(gòu)建的2b-RAD文庫(kù)，經(jīng)Illumina HiSeq 2000測(cè)序后，獲得的原始測(cè)序reads 經(jīng)過(guò)質(zhì)量過(guò)濾，得到高質(zhì)量reads。如表 1所示，高質(zhì)量reads均占測(cè)序原始reads的99%以上，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2.3 標(biāo)簽統(tǒng)計(jì) 以8張384孔培養(yǎng)板板混合得到的二級(jí)池為例。21 356個(gè)BsaXI酶切標(biāo)簽中，定位到單個(gè)克隆的標(biāo)簽數(shù)為1 054，占總標(biāo)簽數(shù)的47.08%；定位到多個(gè)克隆的標(biāo)簽數(shù)為5 063，占總標(biāo)簽數(shù)的23.71%；無(wú)法定位到克隆的標(biāo)簽數(shù)為6 239，占總標(biāo)簽數(shù)的29.21%。141 166個(gè)FspEI酶切標(biāo)簽中，共有40 553個(gè)標(biāo)簽成功定位到單個(gè)克隆，占總標(biāo)簽數(shù)的28.73%；定位到多個(gè)克隆的標(biāo)簽數(shù)為26 046，占總標(biāo)簽數(shù)的18.45%；無(wú)法定位到克隆的標(biāo)簽數(shù)為74 567，占總標(biāo)簽數(shù)的52.82%。其他混合條件下的結(jié)果如表2所示。整體來(lái)說(shuō)，約有50%的BsaXI酶切標(biāo)簽中能定位到克隆上；約有30%FspEI酶切標(biāo)簽?zāi)芏ㄎ坏娇寺∩稀?/p>

表2 BsaXI和FspEI酶切標(biāo)簽解碼統(tǒng)計(jì)

2.2.4 克隆解碼率和平均標(biāo)簽數(shù)統(tǒng)計(jì) 以8張384孔培養(yǎng)板混合得到的二級(jí)池為例，此超級(jí)池共包含克隆3 072(8×16×24)個(gè)。10 054個(gè)定位到克隆上的BsaXI酶切標(biāo)簽，成功解出克隆2 179個(gè)，克隆的解碼率為70.93%，平均每個(gè)克隆所含的標(biāo)簽數(shù)為4.61。40 533個(gè)定位到克隆上的FspEI酶切標(biāo)簽，成功解出2 668個(gè)克隆，克隆解碼率為86.85%，平均每個(gè)克隆所含的標(biāo)簽數(shù)為15.2。聯(lián)合分析BsaXI和FspEI兩種酶切標(biāo)簽，克隆解碼率為88.41%。

其他混合尺度下解碼情況如表3所示，隨著超級(jí)池所含的384孔培養(yǎng)板板數(shù)的增加，即克隆數(shù)量的增加，2種酶的解碼率都明顯下降。4種尺度下，F(xiàn)spEI酶對(duì)應(yīng)的克隆平均標(biāo)簽數(shù)在15個(gè)左右，BsaXI酶對(duì)應(yīng)的克隆平均標(biāo)簽數(shù)在5個(gè)左右。FspEI酶的克隆解碼率高于BsaXI酶的解碼率；聯(lián)合兩種酶切標(biāo)簽進(jìn)行解碼，克隆解碼效率得到明顯提升。

表3 不同混合尺度下克隆的解碼率

3 討論

本研究中，測(cè)序得到的酶切標(biāo)簽根據(jù)解碼情況可以分為三類(lèi)。在對(duì)應(yīng)的行池、列池、板池中，只出現(xiàn)一次的標(biāo)簽，意味著它在三維坐標(biāo)中擁有唯一的點(diǎn)，能夠定位到克隆上，這樣的克隆解碼出的克隆。這樣的標(biāo)簽(克隆)能夠用于重疊群的建立。在行、列、板三種池都出現(xiàn)，但二級(jí)池出現(xiàn)3次及3次以上的標(biāo)簽，能夠定位到多個(gè)克隆。只出現(xiàn)在1種或2種二級(jí)池的標(biāo)簽，無(wú)法定位到克隆。后兩者都不能用于后續(xù)重疊群的分析。對(duì)于定位到多個(gè)克隆的標(biāo)簽，說(shuō)明這個(gè)標(biāo)簽出現(xiàn)在基因組的多個(gè)位置，即該標(biāo)簽有可能是是重復(fù)序列的一部分。對(duì)于無(wú)法定位到克隆的標(biāo)簽，可能是因?yàn)榭寺∩L(zhǎng)不均勻，導(dǎo)致在取樣時(shí)有的二級(jí)池沒(méi)有取到含有該標(biāo)簽的克隆(例如僅在行池和列池中檢測(cè)到，而未在板池中檢測(cè)到)。

對(duì)于定位到克隆的兩種酶切標(biāo)簽的比例，BsaXI的標(biāo)簽有效率約為50%，F(xiàn)spEI的標(biāo)簽有效率約為30%。這可能是由于FspEI為4堿基內(nèi)切酶，在蝦夷扇貝基因組中有比BsaXI更多的酶切位點(diǎn)，相同的混合尺度下，重復(fù)序列來(lái)源的標(biāo)簽更容易被測(cè)到；相同的測(cè)序深度下，定位到克隆的標(biāo)簽更不容易被測(cè)到。同一種酶切標(biāo)簽，混合克隆的數(shù)量提高解碼率會(huì)跟著降低。從4個(gè)384孔培養(yǎng)板板增加到16個(gè)，BsaXI酶的解碼率由72.27%降到68.49%，F(xiàn)spEI酶的解碼率由88.35%降到79.90%。對(duì)比兩種酶切標(biāo)簽，定位到克隆的FspEI標(biāo)簽數(shù)明顯多于BsaXI標(biāo)簽數(shù)，F(xiàn)spEI酶切標(biāo)簽的克隆解碼率明顯高于BsaXI酶切標(biāo)簽的克隆解碼率。

此外，可以通過(guò)構(gòu)建更長(zhǎng)片段的克隆文庫(kù)(如BAC文庫(kù))，來(lái)提高定位到克隆的標(biāo)簽數(shù)，獲得更高的解碼率。更長(zhǎng)的克隆片段包含更多的酶切位點(diǎn)，每個(gè)克隆中所能檢測(cè)到的標(biāo)簽數(shù)目也會(huì)越多，克隆被解碼的概率也隨之增大。克隆片段長(zhǎng)度的增加，組成克隆重疊群的克隆數(shù)目會(huì)越少，也更有利于克隆之間的正確排序。達(dá)到相同的基因覆蓋度，更長(zhǎng)片段的克隆文庫(kù)需要更少的克隆進(jìn)行混池，也能降低WGP法混合池構(gòu)建的成本及測(cè)序的成本；但插入片段越長(zhǎng)，構(gòu)建克隆文庫(kù)的難度越大，實(shí)驗(yàn)成本也會(huì)隨之增加，需要在文庫(kù)的插入片段長(zhǎng)度、成本和實(shí)驗(yàn)難度上做權(quán)衡。

綜合以上分析，在后期的實(shí)驗(yàn)中同時(shí)使用兩種酶，能夠使每個(gè)克隆所含的標(biāo)簽數(shù)目提高，獲得比一種酶更高的解碼率。在結(jié)合實(shí)驗(yàn)成本，測(cè)序成本及比對(duì)實(shí)驗(yàn)的4個(gè)混合尺度下的綜合解碼率之后，本研究最終確定了由8張384孔培養(yǎng)板混合的混池策略及利用BsaXI和FspEI兩種酶切標(biāo)簽聯(lián)合進(jìn)行克隆解碼的解碼方案。該方案聯(lián)合解碼率達(dá)到88.41%，比逐個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序解碼率更高；在獲得高解碼率的同時(shí)，單個(gè)混合樣品包含更多的克隆，降低了測(cè)序成本，為后期利用WGP方法構(gòu)建蝦夷扇貝物理圖譜，提供了克隆混池和解碼參考方案。