朱星海， 孫紅振， 楊祖晶， 孫貴東，邢 強(qiáng)**， 劉 劍， 包振民,3

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003； 2.煙臺海益苗業(yè)有限公司，山東 煙臺 265600；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室，山東 青島 266071)

貝類產(chǎn)業(yè)是中國海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要組成部分,養(yǎng)殖產(chǎn)量超過海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的72%[1]。據(jù)2015年《中國水產(chǎn)》統(tǒng)計，中國共引進(jìn)貝類10余種[2]，如海灣扇貝(Argopectenirradias)[3]、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[4]、紫扇貝(A.purpuratus)[5]和大扇貝(Pectenmaximus)[6]等。自從1980年代引進(jìn)國外優(yōu)質(zhì)扇貝種質(zhì)以來，中國扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)量/產(chǎn)值實現(xiàn)跳躍式增長，扇貝養(yǎng)殖總產(chǎn)量從1984年的0.38萬t增加到2016年的178.53萬t；扇貝養(yǎng)殖總產(chǎn)值從1984年的0.06億美元增長至2016的25.00億美元[7]；中國海水養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)建了新的養(yǎng)殖模式，海灣扇貝與海帶輪養(yǎng)能降低產(chǎn)業(yè)成本，提高利潤率[8]?？梢?，優(yōu)質(zhì)扇貝種質(zhì)的引進(jìn)在促進(jìn)中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展的同時，創(chuàng)造了巨大的產(chǎn)業(yè)價值和經(jīng)濟(jì)價值。

風(fēng)信標(biāo)扇貝(Patinopectencaurinus)隸屬于軟體動物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Lamellibranchia)，異柱目(Anisomyaria)，扇貝科(Pectinidae)，盤扇貝屬(Patinopecten)，原產(chǎn)于美國北部舊金山(37°N)至阿拉斯加灣(60°N)，自然棲息于深度10～300 m內(nèi)的白令海和阿米莉亞群島(53°N,174°W)等海域[9-10]。作為商業(yè)養(yǎng)殖貝類個體最大的種類之一，風(fēng)信標(biāo)扇貝最大個體殼高可達(dá)250 mm[11]，同時因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高，備受北美消費者青睞。自1967年以來，風(fēng)信標(biāo)扇貝在阿拉斯加海灣逐漸形成商業(yè)化捕撈，至2012年產(chǎn)出貝肉凈重約為190 t，為當(dāng)?shù)貏?chuàng)造出約450萬美元經(jīng)濟(jì)價值[11]。重要的是，風(fēng)信標(biāo)扇貝與蝦夷扇貝的生物學(xué)地位相近，同屬于盤扇貝屬(Patinopecten)，并且生活習(xí)性相似，均屬于冷水性貝類，適宜生長水溫為5～20 ℃，分布于底質(zhì)堅硬、淤沙少的海底等[11]，這使中國引進(jìn)風(fēng)信標(biāo)扇貝并形成大規(guī)模商業(yè)化養(yǎng)殖成為可能。2013—2015年，中國海洋大學(xué)與海益水產(chǎn)苗業(yè)有限公司等單位合作，從加拿大(54.32 °N,131.40 °W)引種了風(fēng)信標(biāo)扇貝。新的扇貝物種引進(jìn)將有助于其基因組學(xué)研究、重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)理的解析以及遺傳育種等相關(guān)工作的開展。

標(biāo)準(zhǔn)化的人工育苗是實現(xiàn)扇貝大規(guī)模商業(yè)化養(yǎng)殖的前提條件，而親貝培育又是貝類人工育苗的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，直接影響著雌貝的產(chǎn)卵量、卵子的受精率、受精卵的孵化率以及幼蟲的變態(tài)率[12]等。目前，關(guān)于香港巨牡蠣(Crassostreahongkongensis)[13]、斧文蛤(MeretrixlamarkiiDeshayes)[14]、海灣扇貝(A.irradias)[15]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[16]、蝦夷扇貝(P.yessoensis)[17]等性腺發(fā)育與繁殖周期規(guī)律的研究國內(nèi)外已有報道，但風(fēng)信標(biāo)扇貝在中國的的相關(guān)研究仍為空白。為此，本課題組于2015年從加拿大引進(jìn)了風(fēng)信標(biāo)扇貝并對其性腺發(fā)育和繁殖周期規(guī)律進(jìn)行研究，為貝類遺傳育種研究和人工育苗工作提供重要的理論參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

用于組織切片觀察和性腺指數(shù)測定的風(fēng)信標(biāo)扇貝樣本，為2016年1月—2016年12月采自蓬萊海頭村浮筏養(yǎng)殖區(qū)(37.72°N,121.02°E)3～5 m水深的3齡貝(2013—2015年由中國海洋大學(xué)與海益水產(chǎn)苗業(yè)有限公司等單位合作從加拿大引進(jìn))，除1、2月份外(分別為4、2次)每月采樣3次(上旬、中旬、下旬),每次采集樣本雌雄各6只并進(jìn)行編號記錄。

1.2 方法

1.2.1 水溫測量 在2016年周年采樣期間，除1、2月份外(分別為4、2次)每月使用海水水溫表(WQG-17)3次定期測量蓬萊浮筏養(yǎng)殖海區(qū)風(fēng)信標(biāo)扇貝養(yǎng)殖水層3～5 m的水溫。

1.2.2 樣本測量 使用游標(biāo)卡尺(0～150 mm、0.02 mm、Ⅱ型)分別測量樣本殼長、殼高、殼寬(精確到0.01 mm)。用電子天平(PS200A)稱取樣本鮮重、軟體部重和性腺重(精確到0.01 g)，觀察其性腺發(fā)育程度、性別、顏色，并計算性腺指數(shù)：

1.2.3 組織切片的制作與觀察 首先，根據(jù)肉眼觀察性腺顏色(雌性為橘黃色、雄性為乳白色)區(qū)分扇貝性別并做好標(biāo)記；其次，將風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺組織切成每塊大小5 mm×5 mm，波恩氏(Bouins)液固定24 h，75%乙醇脫水，以石蠟為介質(zhì)將其進(jìn)行包埋成塊，德國SLEE石蠟切片機(jī)(CUT6062)切片，切片厚度為4～7 μm，蘇木素伊紅HE染色，樹膠封片保存，二甲苯透洗切片，尼康生物熒光顯微鏡(Nikon ECLIPS E600)下對染色的性腺組織切片進(jìn)行觀察并通過高分辨率顯微鏡相機(jī)(Nikon DS-Ri1)拍照。

1.2.4 分析方法 對試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理，利用SPSS 23.0軟件(IBM Corp, Armonk, USA)Pearson相關(guān)分析法(雙側(cè)T檢驗)對風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺指數(shù)與海水溫度兩個變量的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺指數(shù)與海區(qū)水溫的關(guān)系

由2016年1月1日—2016年12月31日為期一周年的浮筏養(yǎng)殖風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺指數(shù)變化的連續(xù)觀測可見(見圖1)，2月上旬至8月中旬海水溫度呈上升趨勢，而8月下旬至12月下旬海水溫度則平穩(wěn)回落。1—4月上旬風(fēng)信標(biāo)扇貝的性腺指數(shù)呈現(xiàn)穩(wěn)定連續(xù)增長趨勢，4月中旬到12月中旬則呈現(xiàn)逐漸下降趨勢：1月初性腺指數(shù)逐漸上升，至4月上旬達(dá)到最大值(24.25)，與之對應(yīng)的海水溫度變化趨勢則顯現(xiàn)為“V”型，由1月初的4.2 ℃下降至2月上旬的1.3 ℃(為全年最低水溫)；2月中旬至4月上旬海水溫度從2.2 ℃逐漸上升至9.0 ℃；4月中旬到12月中旬性腺指數(shù)呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢，并在10月中旬出現(xiàn)全年最小值(3.80)，與之對應(yīng)的海水溫度變化趨勢則呈現(xiàn)倒“V”型，期間水溫從4月中旬的11.8 ℃升至8月中旬的26.8 ℃，之后逐漸回落。周年統(tǒng)計期間，蓬萊海頭村海水溫度的波動與風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺指數(shù)的變化呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.483，P< 0.05)，說明海水溫度變化顯著影響風(fēng)信標(biāo)扇貝的性腺發(fā)育和繁殖周期。

圖1 風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺指數(shù)與海區(qū)水溫的變化Fig.1 Monthly change curves of the gonad-somatic index in Weathervane scallop and water temperature

2.2 風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺發(fā)育分期

基于生殖細(xì)胞自身發(fā)育規(guī)律以及不同發(fā)育階段生殖細(xì)胞在濾泡中所占的比例，對2016年1月—2016年12月收集到的樣品性腺組織切片進(jìn)行觀察,將風(fēng)信標(biāo)扇貝的性腺發(fā)育劃分為4個時期,分別為增殖期、生長期、成熟期、休止期。

增殖期(12—次年1月)：該時期的濾泡腔多為空腔，并有原始生殖細(xì)胞在生殖腺的濾泡壁上堆積(見圖2B、F)。

生長期(2—3月)：雄貝濾泡腔內(nèi)出現(xiàn)不同發(fā)育階段的生殖細(xì)胞(見圖2G)，雌貝濾泡中存在游離的卵母細(xì)胞，濾泡壁內(nèi)充滿成熟的長柄狀或不規(guī)則橢圓型卵母細(xì)胞，此時期的卵母細(xì)胞較上一時期體積更大(見圖2C)。

成熟期(4—6月)：雌雄性腺顏色差異較大,雌性為橘黃色,而雄性為乳白色。濾泡此時期最為發(fā)達(dá)，濾泡之間的空隙已基本消失，整個濾泡腔內(nèi)充滿生殖細(xì)胞。雌性濾泡內(nèi)成熟卵占65%～5%，成熟卵細(xì)胞和處于生長后期的卵母細(xì)胞游離在濾泡腔中，卵母細(xì)胞在泡腔內(nèi)相互擠壓，形狀各異(見圖2D)。雄性濾泡內(nèi)充滿密集排列的精細(xì)胞，呈現(xiàn)輻射狀(見圖2H)。

圖2 風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺不同發(fā)育時期的組織切片觀察
Fig.2 Histological observation of different gonadal development stages in Weathervane scallop

休止期(7—11月)：處于該時期的性腺發(fā)育程度最低，濾泡腔為空腔且性腺體積很小，但濾泡壁內(nèi)可見及少量精細(xì)胞或卵細(xì)胞(見圖2A、E)；

2.3 風(fēng)信標(biāo)扇貝繁殖規(guī)律

根據(jù)人工繁育試驗和性腺組織切片的周年觀察結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)風(fēng)信標(biāo)扇貝的繁殖周期為一年。性腺發(fā)育程度與浮筏養(yǎng)殖海區(qū)水溫變化密切相關(guān)，并且處于不同發(fā)育時期的性腺，在其形體特征上存在差異。

12月—次年1月,蓬萊浮筏養(yǎng)殖區(qū)海水溫度逐漸降低，從7.9 ℃平穩(wěn)下降至2.4 ℃，此時期風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺體積逐漸增大，腺體內(nèi)有少量內(nèi)含物，性腺指數(shù)從5.24快速上升至10.32，性腺發(fā)育處于增殖期。

2—3月,蓬萊浮筏養(yǎng)殖區(qū)海水溫度從全年最低的1.3 ℃緩慢上升至6.8 ℃，此時期風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺體積接近其最大值，腺體內(nèi)內(nèi)含物逐漸增多，濾泡內(nèi)生殖細(xì)胞逐漸增多。肉眼可區(qū)分性別，雄貝性腺為乳白色，雌貝性腺則呈現(xiàn)杏黃色。性腺指數(shù)從2月上旬的14.31陡然上升至3月底的22.63，性腺發(fā)育處于生長期。

4—6月,蓬萊浮筏養(yǎng)殖區(qū)海水溫度從9.0 ℃逐漸上升至21.3 ℃，此時期風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺中的濾泡腔充滿了生殖細(xì)胞，濾泡間幾乎沒有空隙。因此性腺狀態(tài)飽滿圓潤，而且體積相比其它器官大。4月性腺發(fā)育進(jìn)入成熟期，平均性腺指數(shù)22.70為全年最高，風(fēng)信標(biāo)扇貝進(jìn)入繁殖盛期。

7—11月,蓬萊浮筏養(yǎng)殖區(qū)海水溫度穩(wěn)定在20.0 ℃左右，此時期風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺體積相比其它器官相對較小，且呈現(xiàn)萎縮、透明、退化狀態(tài)。這5個月平均性腺指數(shù)約為5.10，性腺發(fā)育處于休止期。

總體而言，水溫較低時，低溫使冷水貝類的性腺快速發(fā)育，此時性腺指數(shù)相對較高；反之，水溫較高時，性腺發(fā)育受到溫度協(xié)迫，性腺指數(shù)較低。

此外，課題組進(jìn)行的風(fēng)信標(biāo)扇貝的人工繁育工作也取得了階段性進(jìn)展。2016年2月，選擇體型健壯的、性腺發(fā)育處于生長期的風(fēng)信標(biāo)扇貝入池，進(jìn)行人工促熟。在性腺發(fā)育的繁殖期，挑選性腺發(fā)育較好的雌貝和雄貝(性腺體積大，形態(tài)圓潤飽滿)陰干刺激45～60 min。之后，雌貝和雄貝先后(時間間隔30 min)放入5～12 ℃的新鮮海水中(變溫刺激，持續(xù)45～60 min)，直至風(fēng)信標(biāo)扇貝產(chǎn)卵/精。在該溫度下進(jìn)行人工授精、孵化，選優(yōu)后幼蟲培育水溫逐漸升高至13 ℃，恒溫培育直到稚貝出庫。

3 討論

3.1 年度水溫和性腺指數(shù)變化趨勢

在雙殼貝類的生長過程中，溫度是諸多水生環(huán)境因子中最重要的發(fā)育調(diào)控因素[18-19]。在適溫范圍內(nèi)，貝類的新陳代謝旺盛，這對其攝食、生長、性腺發(fā)育、繁殖等生理活動產(chǎn)生積極的作用[20]。風(fēng)信標(biāo)扇貝屬于冷水性貝類，在水溫較低的冬季，性腺發(fā)育迅速[10]。蓬萊浮筏養(yǎng)殖海區(qū)1—3月海水溫度均低于7.0 ℃，月均性腺指數(shù)上升2.44；4月風(fēng)信標(biāo)扇貝在水溫達(dá)到9.0℃時性腺發(fā)育開始進(jìn)入成熟期，并在4月上旬出現(xiàn)全年性腺指數(shù)峰值(24.25)；4月下旬—6月上旬為該扇貝繁殖盛期，期間平均水溫為14.1 ℃；這與大連塔河灣海區(qū)和黃海北部蝦夷扇貝相關(guān)研究結(jié)論有所差異：黃海北部海區(qū)全年最低海水溫度出現(xiàn)在2月份(該月平均水溫為1.3 ℃)，此時期的性腺發(fā)育速度快；繁殖期為3月中旬—5月中旬，其中3月份的平均性腺指數(shù)25.89為全年最高，繁殖期水溫為8.6 ℃左右[21]；大連塔河灣海區(qū)蝦夷扇貝的繁殖期為4—5月，其性腺指數(shù)峰值(17.27)出現(xiàn)在3月上旬，繁殖期水溫為5.0～6.8 ℃[16]?？梢?，低水溫有助于風(fēng)信標(biāo)扇貝和蝦夷扇貝的性腺發(fā)育。雖然蓬萊浮筏養(yǎng)殖區(qū)風(fēng)信標(biāo)扇貝的繁殖期與中國不同養(yǎng)殖海區(qū)蝦夷扇貝的繁殖時期接近，但繁殖期的水溫存在一定差異，這可能是養(yǎng)殖區(qū)地理位置以及水文條件的差異造成的。海水溫度和性腺指數(shù)在3個不同海區(qū)的變化趨勢，均呈現(xiàn)相對明顯的負(fù)相關(guān)。

3.2 風(fēng)信標(biāo)扇貝的性腺發(fā)育分期

鑒定動物性腺發(fā)育的分期，有助于筆者掌握其性腺發(fā)育規(guī)律和生殖周期的特征。正確劃分扇貝性腺發(fā)育時期是進(jìn)行人工繁殖的理論基礎(chǔ)與實踐指導(dǎo)。但是目前，關(guān)于雙殼類貝類性腺發(fā)育的分期標(biāo)準(zhǔn)尚未形成統(tǒng)一認(rèn)識，多為觀察光學(xué)顯微鏡下拍攝的性腺組織切片結(jié)果而進(jìn)行分期。如吳洪流等[22]將波紋巴非蛤(Paphiaundulata)性腺發(fā)育分為6個時期，分別為休止期、增殖期、生長期、成熟期、排放期和滯留退化期；於鋒[12]將廣西茅尾海香港巨牡蠣(C.hongkongensis)性腺發(fā)育分期為5個時期，未分化期、分化期、成熟排放期和休止期；高悅勉[16]等將大連塔河灣海區(qū)蝦夷扇貝(P.yessoensis)性腺發(fā)育劃分為休止期、增殖期、生長期、成熟期、排放期。本實驗結(jié)合性腺組織切片分析和肉眼觀察的結(jié)果將蓬萊海頭村浮筏養(yǎng)殖區(qū)風(fēng)信標(biāo)扇貝的性腺發(fā)育分為4個時期，分別為增殖期(12月—次年1月)、生長期(2—3月)、成熟期(4—6月)、休止期(7—11月)。Hennick[23]通過肉眼觀察原產(chǎn)于阿拉斯加灣的風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺發(fā)育特征，將其分為5個階段，第一階段為性腺排空期，體積縮小，消化管可見，干癟透明狀，雌雄貝性腺幾乎為無色；第二階段為性腺恢復(fù)初期，性腺體積增大，充滿1/4～1/2內(nèi)含物，消化管隱約可見，雄貝性腺中含生殖細(xì)胞的部分為乳白色，余下腺體為透明狀，雌貝性腺呈淡粉色或淺橙色；第三階段為性腺生長期，性腺體積接近最大，充滿3/4內(nèi)含物，雌貝性腺為淺橙黃色，雄貝性腺為蒼白色；第四階段為性腺成熟期，性腺體積較其它器官大，形態(tài)圓潤，雄貝性腺為乳白色，雌貝性腺為橘黃色；第五階段為性腺發(fā)育早期或未成熟期，性腺體積較其它器官小，平滑透明無色。通過觀察，筆者發(fā)現(xiàn)阿拉斯加灣風(fēng)信標(biāo)扇貝與蓬萊浮筏養(yǎng)殖海區(qū)風(fēng)信標(biāo)扇貝性腺發(fā)育特征相似。例如，雄貝性腺成熟時顏色均為乳白色，雌貝性腺成熟時顏色均為橘黃色、性腺體積大、形態(tài)圓潤等，而且兩種扇貝在生產(chǎn)后，雌雄貝的性腺均逐漸變?yōu)榘T平透明狀[23]。此后，扇貝性腺進(jìn)入恢復(fù)初期，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，性腺內(nèi)含物的積累，其體積逐漸增大。但是由于不同地理環(huán)境(水溫等)、取材個體差異，目前引進(jìn)到中國的風(fēng)信標(biāo)扇貝在性腺發(fā)育過程出現(xiàn)了不同于原產(chǎn)地個體的新特征，不同地區(qū)扇貝在生長階段的性腺內(nèi)含物比例有所不同，阿拉斯加灣風(fēng)信標(biāo)扇貝的性腺充滿3/4內(nèi)含物，而引進(jìn)中國的風(fēng)信標(biāo)扇貝的性腺充滿約1/2內(nèi)含物等；蓬萊浮筏養(yǎng)殖海區(qū)風(fēng)信標(biāo)扇貝的繁殖盛期在為4月下旬—6月上旬(春末夏初)，而阿拉斯加灣風(fēng)信標(biāo)扇貝的繁殖期主要集中在夏季初，為6月上旬—7月中旬[23]。

綜上所述，該實驗課題組在引進(jìn)風(fēng)信標(biāo)扇貝的基礎(chǔ)上，探究其性腺發(fā)育與繁殖周期變化規(guī)律。性腺發(fā)育分為4個時期，根據(jù)本文所歸納性腺發(fā)育的特征可以對風(fēng)信標(biāo)扇貝的繁殖時間段進(jìn)行預(yù)測。通過獲得海水溫度的實時變化，研究者在一定程度上可以預(yù)估該扇貝群體性腺指數(shù)的變化趨勢。研究結(jié)果不僅填補(bǔ)了其性腺發(fā)育研究方向上的空缺，同時為風(fēng)信標(biāo)扇貝的人工繁育和商業(yè)養(yǎng)殖開發(fā)提供了重要的理論指導(dǎo)。

致謝：本文中風(fēng)信標(biāo)扇貝個體的取樣和海水溫度測量工作均在煙臺海益苗業(yè)有限公司的大力協(xié)助下完成，在此表示感謝。