侯媛媛， 陳慕雁

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學(xué))， 山東 青島 266003)

棘皮動物、脊索動物類和半索亞門類動物共同構(gòu)成了后口動物，這使得棘皮動物成為研究脊索動物類起源的重要節(jié)點。棘皮動物成體具有獨特五重對稱結(jié)構(gòu)，其神經(jīng)系統(tǒng)一般包括一個圍口神經(jīng)環(huán)和相連的5條徑向神經(jīng)線，這5條徑向神經(jīng)線穿梭在身體的縱肌和環(huán)肌之間。大多數(shù)棘皮動物(除了海百合類)的神經(jīng)系統(tǒng)都被認(rèn)為包含兩個獨立的部分:外神經(jīng)系統(tǒng)和深層神經(jīng)系統(tǒng)，它們被基底膜所分隔[1-2]，在神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化的研究中占據(jù)了重要的地位。然而由于棘皮動物神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的獨特性及難以定位，使得其中央神經(jīng)系統(tǒng)研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他動物。

海參綱(Holothuroidea)是棘皮動物進(jìn)化中出現(xiàn)最晚的一個綱，和海膽綱(Echinoidea)的親緣關(guān)系最近[2]。仿刺參(Apostichopusjaponicus)作為海參綱的代表種，是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟物種, 具有極高的食用與醫(yī)用價值，主要分布于我國遼寧、河北、山東沿岸淺海[3]。目前仿刺參以其獨特的進(jìn)化地位和特殊的生理特性(再生，自溶，夏眠)日益受到關(guān)注[4-7]，然而關(guān)于仿刺參的神經(jīng)定位的研究國內(nèi)外尚鮮有報道，有限的研究主要集中在少數(shù)幾種神經(jīng)肽的發(fā)掘和組織定位[1,8-9]。本研究中，我們利用組織學(xué)技術(shù)結(jié)合棘皮動物神經(jīng)的特異性抗體1E11[10]，初步探究刺參腸道中神經(jīng)的定位。已有研究表明，刺參腸道具有很強的再生能力以及長期夏眠萎縮后的快速修復(fù)能力[11-12]，然而相關(guān)研究都主要局限于傳統(tǒng)的組織學(xué)描述，并沒有對此過程中起到關(guān)鍵作用的神經(jīng)定位進(jìn)行分析，我們期望通過腸道神經(jīng)定位的基礎(chǔ)研究，為刺參特殊生理機制以及刺參神經(jīng)生物學(xué)的研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和暫養(yǎng)條件

仿刺參成體體重(100±10) g，取自山東省青島市膠南刺參養(yǎng)殖場。實驗前，置于實驗室循環(huán)水水槽內(nèi)暫養(yǎng)7 d，水溫15～18 ℃。定量投喂人工配合飼料 (海泥和鼠尾藻(Sargassumthunbergii)按比例混合而成)，以確保刺參盡快適應(yīng)環(huán)境。

1.2 樣品固定及制備

取健康狀況良好不吐腸的仿刺參9～10頭，停食72 h，待其排空消化道內(nèi)食物殘渣后，將其放入盛有1 L新鮮海水配置的0.3 mol/L硫酸鎂溶液中。待仿刺參運動減弱，觸手、管足伸展且不再收縮為止。取出仿刺參個體，進(jìn)行解剖，取出腸道樣品，大小尺度約1～2 mm2,蒸餾水對其進(jìn)行沖洗。

HE，米利根染色樣品制備：波恩液固定12～24 h；樣品經(jīng)不同濃度梯度酒精脫水(70%、80%、95%、95%、100%和100%，每步30 min)；完全脫水后組織轉(zhuǎn)入100%酒精∶二甲苯=1∶1的混合液中30 min，在二甲苯中透明20 s；透明后樣品依次在二甲苯∶石蠟=1∶1，石蠟中分別浸泡25 min，二次浸泡在純石蠟中50 min包埋，冷卻后修片，切片厚度調(diào)整為7 μm。

1E11免疫組化樣品制備：樣品在pH=7.4的4%多聚甲醛/PBS中短時間固定最多10 min，固定之后，樣品用PBS(3×5 min)洗滌，然后通過在一系列上升濃度蔗糖溶液(10%，20%和30%，每步3 h，室溫)中撫育被凝凍保護(hù)。樣品用OCT包埋后，立刻放入-80 ℃冰箱中。用萊卡CM3050 S 低溫切片12 μm并在多聚賴氨酸載玻片上收集，保存在-20 ℃。

1.3 切片染色

1.3.1 HE染色 切片用蘇木精和伊紅分別染色后，擦去切片周圍多余二甲苯，迅速在切片上滴加適量中性樹膠，蓋上載玻片，注意不要有氣泡，玻片晾干后用Nikon E 600顯微鏡觀察切片并拍照。

1.3.2 米利根染色 切片用二甲苯澄清5 min，在純酒精中水合5 min，切片用如下方法染色：溶液A(2.25 g重鉻酸鉀、2.25 mL濃鹽酸加入含25 mL的95%酒精和75 mL的蒸餾水中)中5 min，蒸餾水洗滌2 min;溶液B(0.1 g品紅加入100 mL蒸餾水中)中5 min，蒸餾水快洗30 s;溶液C(1 g磷鉬酸加入100 mL蒸餾水中)中1 min，蒸餾水洗2 min;溶液D(2 g的Orange G和1 g的磷鉬酸分別加入100 mL蒸餾水中)中染色5 min，蒸餾水水洗2 min;溶液E(1 mL冰醋酸加入100 mL蒸餾水中)、F(在100 mL蒸餾水中加入Fast green FCF 0.1 g，冰醋酸0.2 mL)，E中分別染色2、5和3 min。這個過程完成之后，切片在純酒精中脫水5 min，二甲苯中澄清5 min，迅速在切片中央滴加一滴中性樹膠，蓋上蓋玻片，用中性樹膠蓋片。染色好的切片用尼康Eclipse E600顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 免疫組化染色 將樣品玻片浸入修復(fù)緩沖液(pH=6.0的緩沖液：0.1 mol/L的A液(檸檬酸鈉 Na3C6H5O7·2H2O 29.4g 加蒸餾水至1 L)16.2 mL，0.1 mol/L的B液(檸檬酸C6H5O7·H2O 21.0 g 加蒸餾水至1 L)3.8 mL，加蒸餾水稀釋至200 mL進(jìn)行抗原熱修復(fù)，高壓滅菌鍋內(nèi)120 ℃，7 min，自然冷卻至室溫后將玻片從修復(fù)緩沖液中取出，將載玻片四周擦干凈，用免疫組化防水筆將組織圈起；在圈起的組織上滴加1%H2O2-PBS(1 μL H2O2，1 mL PBS)，濕盒內(nèi)室溫孵育20 min消除內(nèi)源性酶，PBST漂洗5 min×3；漂洗后，組織上滴加5%羊血清/PBST溶液，在濕盒內(nèi)37 ℃封閉背景2 h，甩去多余液體，不洗。

實驗組樣品滴加1∶3(5%羊血清:PBST)稀釋的鼠源一抗1E11(加拿大維多利亞大學(xué)Dr. Robert D. Burke[13]提供)，對照組樣品滴加1∶10(5%羊血清:PBST)稀釋的一抗1E11，玻片濕盒內(nèi)4℃過夜；次日PBST漂洗3次，1次5 min；漂洗過后，實驗組、對照組組織上滴加稀釋后的羊抗鼠辣根過氧化酶二抗(藥明康德AB-ASS1021)(二抗：2%羊血清/PBST 1∶500稀釋)，將其放入濕盒內(nèi)37 ℃孵育3 h，隨后PBST漂洗3次，一次5 min。

用增強型DAB顯色緩沖液發(fā)色，直到能觀察到染色，迅速對切片用PBS，滅菌水順序洗滌，然后滴加Hydromount，蓋上蓋玻片，用Olympus BX51顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 腸道組織學(xué)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)定位

仿刺參的腸道根據(jù)其延伸的方向和附著的位置可分為前腸、中腸和后腸，前腸附著于背腸系膜，位于食道、胃下方，腸道向下延伸快到泄殖腔處為第一下降部即前腸，然后其轉(zhuǎn)向左邊往上延伸為上升部即中腸，中腸附著于側(cè)腸系膜，至咽部下方沿腹中線向下延伸至肛門為第二下降部即后腸，后腸附著于腹腸系膜上(見圖1a)。

仿刺參腸壁由外向內(nèi)分為4層：(1)外層的體腔上皮層即漿膜層；(2)肌肉層，其內(nèi)層為縱肌層，外層為環(huán)肌層；(3)內(nèi)部結(jié)締組織層即黏膜下層；(4)腸腔上皮層即黏膜層。仿刺參中腸上皮皺襞不規(guī)則，常形成高、窄的褶皺，且方向較單一，有的褶皺還有分支(見圖1b)，而后腸皺襞與中腸相比較低，無橫向皺襞，縱向皺襞較規(guī)則且高低不一，其黏膜下層疏松結(jié)締組織與中腸相比較厚，黏膜層向疏松結(jié)締組織凹陷，形成近似長方形或三角形的褶皺，其黏膜上皮多由單層柱狀細(xì)胞構(gòu)成，且細(xì)胞排列整齊(見圖1c)，圖1d中可看出后腸黏膜上皮中有少量橢圓形空泡狀的杯狀細(xì)胞，HE染色為無色，且肌肉層也呈現(xiàn)外環(huán)內(nèi)縱排列，環(huán)形肌纖維比縱肌纖維更明顯，其外膜由復(fù)層上皮細(xì)胞和結(jié)締組織構(gòu)成。

仿刺參腸道內(nèi)壁有橫向、縱向褶皺，中腸常形成高而窄且方向單一的褶皺，后腸多為較規(guī)則的縱向褶皺，后腸黏膜層多為單層或復(fù)層的黏膜上皮與崔龍波[14]的結(jié)論一致。同時，仿刺參的前腸和中腸因細(xì)胞內(nèi)含較多的核酸，且呈現(xiàn)非特異性酯酶和蛋白酶脂酶活性而起主要的消化吸收作用[14]，而中腸內(nèi)壁與后腸相比，其內(nèi)壁大量高而窄的褶皺，在結(jié)構(gòu)上擴大了吸收面積，體現(xiàn)了結(jié)構(gòu)功能相統(tǒng)一的原理。

米利根染色結(jié)果表明：核、肌肉染為紅色，膠原蛋白(纖維)染為藍(lán)色，神經(jīng)系統(tǒng)染為淺紫色。從圖2b中可看出腸壁的縱向肌肉染為紅色，整條縱肌偏紫，表明肌肉細(xì)胞中神經(jīng)纖維的存在；腸腔上皮層中神經(jīng)成分較多(顏色深)，其次是體腔上皮層(黑色箭頭)，這與García-Arrarás[15]在海參(Holothuriaglaberrima)中的研究結(jié)果類似，他們在H.glaberrima腸壁中發(fā)現(xiàn)，從外向內(nèi)的體腔上皮層、肌肉層、內(nèi)部結(jié)締組織層和內(nèi)里的腸腔上皮層中均含有神經(jīng)成分。

(a. 刺參腸道解剖圖；b. 腸道中腸橫切HE染色；c. 腸道后腸橫切HE染色；d. 圖c局部放大圖。a. The intestinal tract ofA.japonicus; b. Transverse section of the mid-intestine with HE staining; c. Transverse section of the posterior intestine with HE staining;; d. Local magnification of figure c. il：腸腔；sce：單層柱狀上皮；ct：結(jié)締組織；g：杯狀細(xì)胞；lm：縱向肌肉；cm：環(huán)形肌肉; ai: 前腸; mi: 中腸; pi: 后腸。il: Intestine lumen; sce:Simplecolumnarepithelium; ct: Connective tissue; g: Goblet cells; lm: Longitudinal muscle; cm: Circular muscle; ai: Anterior intestine; mi: Mid-intestine; pi: Posterior intestine.)

圖1 仿刺參腸道的HE染色圖

Fig.1 The HE staining images of intestine ofA.japonicus

(a. 后腸橫切米利根染色；b. 圖a為局部放大圖。a.Transverse section of the posterior intestine with Milligan staining; b. Local magnification of figure a.il：腸腔； ct：結(jié)締組織；lm：縱向肌肉；ce：體腔上皮；ie：腸腔上皮。il: Intestine lumen; ct: Connective tissue; lm: Longitudinal muscle; ce: Coelomic epithelium layer; ie: Intestine epithelium layer.)

圖2 仿刺參腸道的米利根染色圖

Fig.2 The Milligan staining images of intestine ofA.japonicus

相比HE染色法顯示組織細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)而言，米利根染色法更適用于觀察肌肉、膠原、神經(jīng)系統(tǒng)的分布，其能使組織中的各主要成分以不同顏色顯現(xiàn)出來，色彩對比鮮明，更易觀察染色結(jié)果[16]。Inoue[1]、Tamori[9]等分別用米利根染色來研究仿刺參徑向神經(jīng)線的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，為后續(xù)研究神經(jīng)肽NG1WYamide和stichopin的分布及功能驗證提供理論基礎(chǔ)；而Inoue[17]等利用米利根染色觀察了仿刺參體壁整體的神經(jīng)纖維和分支分布，為仿刺參體壁縱向肌肉受內(nèi)神經(jīng)支配結(jié)論的提出奠定了基礎(chǔ)。

2.2 腸道中免疫組化神經(jīng)定位

1E11是突觸結(jié)合蛋白B的神經(jīng)元特異性抗體[13,18]。Burke等[13]的研究表明球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)徑向神經(jīng)提取物中1E11對突觸結(jié)合蛋白B的特異性結(jié)合。目前已經(jīng)在許多棘皮動物的幼體和部分成體中驗證了1E11的神經(jīng)元特異性結(jié)合特性，這使得1E11單克隆抗體成為棘皮動物神經(jīng)的公認(rèn)標(biāo)記物[9-10,18-19]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)1E11是仿刺參成體神經(jīng)組織的良好標(biāo)識物。研究中我們利用1E11抗體對仿刺參腸道陰性對照組(1∶10稀釋)、實驗組(1∶3稀釋)神經(jīng)組織進(jìn)行化學(xué)定位，采用DAB染色，最終呈現(xiàn)出的棕黃色顆粒為陽性雜交位點。研究結(jié)果表明，1E11在陰性對照組中的肌肉層中有表達(dá)，而在最外層的體腔上皮層和肌肉層下方的內(nèi)部結(jié)締組織中鮮有活性反應(yīng)(見圖3a)；實驗組中1E11 在腸道組織的陽性反應(yīng)廣泛而強烈，體腔上皮層、肌肉層、內(nèi)部結(jié)締組織層均有染色，且肌肉層中染色最深(見圖3b)。

仿刺參神經(jīng)系統(tǒng)不同于脊椎動物，沒有腦部結(jié)構(gòu)，是由圍口神經(jīng)環(huán)和分散輻射對稱的5條徑向神經(jīng)線整合在一起，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。盡管仿刺參的神經(jīng)系統(tǒng)較為簡單且缺乏特化的感受器，但仿刺參在正常情況下的復(fù)雜且協(xié)調(diào)的運動及其特殊的生理現(xiàn)象[5,7,20]顯示了其神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的高度協(xié)調(diào)性[2]。

Anderson等[21]研究表明，在與海參親緣關(guān)系很近的海星(Leptasteriaspusilla)臂的再生依賴于神經(jīng)的再生。而在海參綱動物中，腸道是其吐臟再生的首個器官[20]，García-Arrarás[15]用單克隆抗體和標(biāo)記技術(shù)在海參腸道再生完成之前觀察到了神經(jīng)成分，與我們的研究結(jié)果一致；此外，Díaz-Miranda等[22]在海參中第一次分離純化了海參綱的肽類物質(zhì)GFSKLYFamide和SGYSVLYFamide，并用放射免疫分析方法檢測到其分布于腸道的神經(jīng)細(xì)胞和纖維中，其中GFSKLYFamide會導(dǎo)致海參腸道的肌肉張力松弛[23]。這同樣支持了我們利用1E11免疫組化染色結(jié)果中肌肉染色強陽性結(jié)果。除再生外，刺參在夏眠這一特殊生理習(xí)性期間，最顯著的變化是腸道組織的整體退化，變細(xì)變短[24]，在夏眠解除后，其腸道組織迅速在短時間內(nèi)恢復(fù)正常的尺寸和功能。Inoue等[1]研究表明神經(jīng)肽NGIWYamide在調(diào)節(jié)仿刺參腸肌活性方面有一定的作用。結(jié)合本文的研究結(jié)果，推測仿刺參腸道內(nèi)存在可控制夏眠期間腸道肌肉的神經(jīng)肽，而其通過神經(jīng)系統(tǒng)起作用。

(a. 腸道1E11免疫組織化學(xué)反應(yīng)陰性對照(1∶10稀釋)；b. 腸道1E11免疫組織化學(xué)反應(yīng)，箭頭呈強陽性反應(yīng)(1∶3稀釋)。a. Intestinal 1E11 immunohistochemical reaction in negative control(1∶10 dilution); b. Intestinal 1E11 immunohistochemical reaction, the arrow shows the strong positive reaction (1∶3 dilution).I：腸腔；M：肌肉層；ct：相連組織； ce：體腔上皮。I. Intestine lumen; M. Muscle layer; ct: Connective tissue; ce: Coelomic epithelium layer.)

圖3 仿刺參腸道橫切1E11免疫組化染色

Fig.3 The Immunohistochemistry 1E11 staining images of the cross-section intestine ofA.japonicus

3 結(jié)語

本研究利用HE、米利根染色及免疫組化技術(shù)對仿刺參腸道的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)分布進(jìn)行了觀察、分析和探討。研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參中腸內(nèi)壁常形成高且窄的褶皺，這一擴大吸收面積的結(jié)構(gòu)特點與其主要起消化吸收作用的功能一致，通過米利根染色發(fā)現(xiàn)仿刺參腸壁的縱向肌肉、腸腔上皮層和體腔上皮層均存在神經(jīng)成分，免疫組化研究結(jié)果顯示1E11在腸道的每個組織層均有表達(dá)，且肌肉層中分布最多。本研究中觀察到的仿刺參腸道內(nèi)存在的神經(jīng)組織是神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，我們推測其在調(diào)控肌肉神經(jīng)支配上起作用，參與腸道的再生過程及長期夏眠萎縮后的腸道快速修復(fù)過程，關(guān)于這一點尚待深入研究。