朱虹　盧石韋　鄒霞　胡昕　高軍

[摘要] 目的 研究鋅指增強子結合蛋白（ZEB1）、E-鈣粘附蛋白（E-cadherin）在子宮內膜異位癥（Endometriosis EMs，簡稱內異癥）中的表達情況，探索兩者在內異癥發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法 收集住院手術的內異癥手術組織標本80例（包括盆腔外特殊部位的內異癥12例，深部內異癥10例、卵巢內異癥38例，同期在位內膜20例），正常子宮內膜20例作為對照，采用免疫組化SP法檢測ZEB1、 E-cadherin蛋白在上述各組標本中的表達，分析ZEB1、E-cadherin在內異癥中表達的相關性，探討兩者的表達與內異癥臨床分期的關系。 結果 （1）ZEB1在所有異位內膜中呈陽性表達的有48例，陽性率為80%，在位內膜陽性表達2例，陽性率為10%;正常內膜中不表達。ZEB1在異位內膜陽性表達顯著高于在位內膜和正常內膜（P<0.001）;卵巢型內異癥中ZEB1表達與臨床分期無明顯相關性;（2）E-cadherin在正常內膜中100%表達，異位內膜中表達率呈不同程度的缺失，各組中的表達有顯著性差異（P<0.001）;（3）在內異癥中ZEB1的表達與E-cadherin的表達呈負相關。 結論 ZEB1在內異癥中表達顯著升高，并與E-cadherin表達呈負相關，提示ZEB1可能通過抑制E-cadherin的表達，促進上皮間質轉化（EMT）的發(fā)生，在內異癥侵襲轉移中發(fā)揮重要作用。

[關鍵詞] 子宮內膜異位癥;ZEB1;E-cadherin;免疫組織化學

[中圖分類號] R711.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）28-0031-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of zinc finger enhancer binding protein （ZEB1） and E-cadherin （E-cadherin） in endometriosis EMs（endometriosis EMs） and their role in the development of endometriosis. Methods 80 patients with endometriosis surgical tissue in our hospital were collected（including 12 cases of endometriosis in special part outside the pelvic cavity， 10 cases of deep endometriosis， 38 cases of ovarian endometriosis， 20 cases of eutopic endometriosis. Twenty cases of normal endometrium were used as controls. The expression of ZEB1 and E-cadherin proteins in the above groups were detected by immunohistochemical SP method. The correlation between ZEB1 and E-cadherin expression in endometriosis was analyzed. The relationship between their expression and clinical stage of endometriosis was explored. Results ①There were 48 cases of ZEB1 positively expressed in all ectopic endometrium， and the positive rate was 80%. There were 2 cases of positive expression of eutopic endometrium， and the positive rate was 10%. ZEB1 was not expressed in normal endometrium. The positive expression of ZEB1 in ectopic endometrium was significantly higher than that in eutopic endometrium and normal endometrium（P<0.001）.There was no significant correlation between ZEB1 expression and clinical stage in ovarian endometriosis.②E-cadherin is 100% expressed in normal endometrium. The expression rate of ectopic endometrium showed different degrees of loss， the expression of each group was significantly different（P<0.001）.③ZEB1 expression was negatively correlated with E-cadherin expression in endometriosis. Conclusion ZEB1 expression is significantly increased in endometriosis and negatively correlated with E-cadherin expression， suggesting that ZEB1 may promote the development of epithelial-mesenchymal transition （EMT） by inhibiting the expression of E-cadherin， which plays an important role.

[Key words] Endometriosis; ZEB1; E-cadherin; Immunohistochemistry

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs，簡稱內異癥）指具有生長功能的子宮內膜腺體和間質種植在子宮腔被覆黏膜以外，在育齡期婦女中發(fā)病率可達10%～15%[1]，可導致痛經不孕、盆腔痛及月經改變等癥狀，嚴重影響婦女的生活質量。雖然內異癥是一種良性疾病，但卻有類似惡性腫瘤發(fā)生侵襲、轉移的特性[2]，因此，研究者們常從惡性腫瘤的發(fā)生機制入手，研究內異癥的發(fā)生發(fā)展。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞失去原有的形態(tài)、排列極性及細胞間的鏈接，表面黏附分子發(fā)生改變，最終變成具有遷移能力的間質細胞表型，是腫瘤侵襲轉移的關鍵步驟[3-4]。EMT受到多種轉錄因子的調控，其中，ZEB家族作為EMT的核心轉錄因子，在多種腫瘤中被證實可以通過抑制E-cadherin的表達，促進EMT的發(fā)生[5]。本研究中，我們通過檢測ZEB1和E-cadherin蛋白在內異癥中的表達情況，研究二者與EMT及內異癥侵襲轉移的關系，為內異癥提供新的診療思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究共收集組織標本100例，均來自南昌大學第三附屬醫(yī)院婦科的住院患者，所有標本均經病理證實，其中卵巢型子宮異位內膜囊腫38例（巧克力囊腫），深部內異癥（deep infiltrating endometriosis，DIE）的異位內膜組織10例，盆腔外內異癥病灶12例，同期的在位內膜20 例，以正常子宮內膜20 例作為對照。盆腔外內異癥組標本采集于2010年1月～2018年12月的石蠟標本，異位的部位包括宮頸2例，會陰1例，腹壁9例;38例卵巢異位內膜組標本及10例DIE標本采集于2016年8月～2018年12月收治的內異癥患者，年齡24～52歲，平均34.8歲。按照1997年美國生育協(xié)會修改的rAFS分期法[6]，Ⅰ期7例、Ⅱ期12例、Ⅲ期8例、Ⅳ期11例;20例卵巢內異癥患者在位內膜取自上述因內異癥而行子宮切除的子宮在位內膜，或診刮所得的子宮內膜;正常對照組為同期因子宮肌瘤或輸卵管性不孕住院手術診刮所得的子宮內膜，均排除其他子宮內膜病變。兩組的年齡無統(tǒng)計學差異。所有患者術前6個月未用過內分泌藥物，6個月內無妊娠和哺乳史，均有完整的臨床和病理資料。

1.2 主要試劑

兔抗人ZEB1多克隆抗體（ab87280）、鼠抗人E-cadherin多克隆抗體（ab233766）購自Abcam公司，免疫組化SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

離體新鮮標本取材后置于4%多聚甲醛中固定，脫水，石蠟包埋，每份標本切片3張，厚度為4 μm，盆腔外內異癥病例自病理科收集既往病例蠟塊重新切片。分別進行HE染色和鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶法（SP法）免疫組化染色。

免疫組化結果判定指標為細胞漿/細胞膜內棕黃色顆粒狀著色即為陽性。結果判斷在雙盲下進行，每張切片由兩名經驗豐富的病理科醫(yī)生分別計數(shù)。判定標準采用半定量評分法，結合細胞染色的百分比及染色強度進行判定[7]。染色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分;陽性細胞百分比：無陽性細胞為0分，1%～為1分，10%～為2分，50%～為3分，75%～為4分。2項評分乘積≤4為陰性，>4分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS23.0軟件，計數(shù)資料采用百分比（%）表示，組間陽性率比較采用Pearson χ2檢驗，兩兩比較采用χ2檢驗Fisher確切概率法。采用Pearson法進行相關性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ZEB1、E-cadherin蛋白的陽性表達定位

ZEB1蛋白的陽性表達主要見于子宮內膜腺上皮細胞的細胞漿和細胞核，淺黃色或棕黃色顆粒見封三圖1～4;E-cadherin蛋白的陽性表達定位于細胞膜和細胞漿，兩者在各組中的表達情況見封三圖5～8。

2.2 ZEB1蛋白在內異癥中的表達情況

在異位內膜中，ZEB1的陽性表達有48例，陽性率為80%，在位內膜中陽性表達有2例，陽性率為10%，為淺黃色顆粒;在正常子宮內膜中無ZEB1的陽性表達見封三圖1～4。ZEB1在異位內膜中的陽性表達率顯著高于在位內膜和正常內膜，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）;在DIE和盆腔外異位病灶中的表達與卵巢型內異癥相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;在位內膜和正常內膜中ZEB1表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3 卵巢內異癥中ZEB1蛋白表達與臨床分期的關系

Ⅰ～Ⅱ期卵巢內異癥異位內膜ZEB1的表達陽性率與Ⅲ～Ⅳ期相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示內異癥中ZEB1的表達與rAFS臨床分期無明顯相關性。見表2。

2.4 E-cadherin蛋白在內異癥中的表達情況

在異位內膜中，E-cadherin有10例陽性表達，陽性率為16.67%，在位內膜中陽性表達有19例，陽性率為95%;正常內膜的陽性表達率為100%。E-cadherin在異位內膜中的陽性表達率低于在位內膜和正常內膜，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）;在DIE和盆腔外異位病灶中的表達與卵巢型內異癥相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;在位內膜和正常內膜中E-cadherin表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.5 ZEB1蛋白與E-cadherin蛋白表達的相關性

在異位內膜中，ZEB1表達陽性的病例48例，其中44例E-cadherin表達陰性;ZEB1表達陰性的病例12例，其中6例E-cadherin表達陽性。相關性統(tǒng)計分析結果顯示，ZEB1與E-cadherin表達呈負相關（r= -0.447，P<0.001）。見表4。

3 討論

3.1 內異癥中的EMT現(xiàn)象

內異癥仍然是臨床治療中的難題之一，嚴重危害女性的身心健康，其發(fā)病機制目前認為完全明了。內異癥具有侵襲生長、遠處轉移、高復發(fā)率的特點，因此很多學者認為它是一類與惡性腫瘤類似的疾病。大量研究表明，EMT是上皮性腫瘤侵襲轉移的關鍵步驟[3-4]。EMT的主要過程是上皮細胞失去上皮表型，轉變?yōu)榭勺杂梢苿拥拈g質細胞，從而變得更具有侵襲性，甚至可抵抗細胞毒性藥物的作用[8]，在這一過程中，維持細胞間黏附和緊密排列的上皮性黏附分子E-cadherin表達缺失，間質分子標記物Vimetin表達升高，從而使上皮細胞間連接松散，失去極性。E-cadherin的下調是EMT的標志性事件[9]。在多種上皮性惡性腫瘤中，可觀察到E-cadherin蛋白的下調和Vimetin蛋白的上調[10]。

近年來，EMT在內異癥中的研究陸續(xù)被報道，如上皮性標記物keratins和E-cadherin的上調，N-cad、Twist、Snail、Vimentin、S100A4、TGF-β等mRNA的下調在內異癥中均有報道[11-13]。盡管報道不多，但仍為EMT在內異癥中的研究開啟了新的篇章。

本研究采用免疫組化方法檢測不同部位內異癥異位內膜組織中E-cadherin蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)在異位內膜中，E-cadherin表達不同程度的缺失，盆腔外為16.67%（2/12），DIE為10%（1/10），卵巢型的陽性率為18.42%（7/38），在位內膜的陽性率為95%（19/20），正常內膜為100%，以上結果表明在內異癥中確實存在EMT現(xiàn)象，這與Bartley J[11]的結果類似，而在Matsuzaki S[13]的研究中，不但證實了內異癥中存在EMT和MET現(xiàn)象，還更加詳細地描述了不同部位異位病灶EMT相關蛋白的表達差異：在腹膜黑色病灶中、DIE病灶中，表達比正常內膜、腹膜紅色病灶、卵巢型異位病灶增高，并且保持間質細胞標記物（Vimentin、S100A4）的表達，此外DIE病灶中的上皮細胞β-catenin表達要高于腹膜紅色、黑色病灶、卵巢型異位病灶，這些結果表明，MET過程更多地發(fā)生于DIE病灶中。本研究中，僅有少數(shù)的異位內膜的E-cadherin呈現(xiàn)陽性表達，故仍提示在異位病灶中更易出現(xiàn)EMT而導致病灶的侵襲轉移。

3.2 ZEB1蛋白在內異癥中表達增高，并與EMT相關

EMT過程中重要的轉錄因子包括Snail家族、ZEB1/ZEB2、Slug、Twist等[5]，其中，ZEB1是腫瘤進展的關鍵調節(jié)因子，ZEB1又稱為鋅指-含同源框轉錄調節(jié)因子delta-球蛋白增強子，ZEB1介導的信號通路亦是EMT最重要的通路之一[14]。此外，ZEB1可通過其C端結合蛋白（C-terminal binding protein，CTBP）參與抑制E-cadherin基因的表達，進一步促進細胞侵襲轉移能力的增強[15]。國內學者張曉軍等[16]發(fā)現(xiàn)，子宮內膜腺癌中存在EMT現(xiàn)象，miRNA/ZEB1信號通路可對EMT過程中重要的分子標記物產生抑制作用。李曉婷等[17]體外實驗中發(fā)現(xiàn)，整合素A2（ITGA2）可調控ZEB1表達，促進卵巢癌細胞的侵襲轉移，當二者降調后，卵巢癌細胞的侵襲轉移作用受到抑制。在宮頸癌的研究中，潘琳[18]發(fā)現(xiàn)ZEB1在宮頸癌細胞系均有不同程度的表達，提示ZEB1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。在內異癥的研究中，Philip CL等[19]發(fā)現(xiàn)子宮內膜間質細胞中ZEB1的表達下調，而在子宮內膜上皮細胞中表達上調，并與TGF-β、BMP2、COX2等形成信號通路激活EMT過程。Furuya M等[20]則發(fā)現(xiàn)異位內膜中存在ZEB1的高表達，在正常內膜中不表達，提示ZEB1可通過EMT在內異癥進展中發(fā)揮重要作用，是一個潛在的轉移預測因子。而在Konrad L等[21]的研究中，發(fā)現(xiàn)盡管在異位內膜組織中，ZEB1表達明顯增加，但上皮性的標記物如K18、K19、MUC1等持續(xù)表達，上皮細胞的表型并未丟失，因此EMT可能在內異癥中有一部分的作用，但并不是主要的致病因素。

本研究通過檢測ZEB1蛋白在不同類型內異癥中的表達，分析其與臨床分期的關系，初步探討了ZEB1在內異癥EMT及其發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移中的作用，結果顯示，ZEB1陽性表達定位于細胞漿/細胞核，在異位內膜中的陽性率為80.00%（48/60）（盆腔外83.33%（10/12），DIE 100.00%（10/10），卵巢型73.68%（28/38），在位內膜中表達極低，陽性率為10.00%（2/20），正常內膜中不表達，三者之間相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），在DIE病灶中陽性率最高，這也與臨床上DIE病灶癥狀重、浸潤種植病灶深等特征相關。盆腔外的異位病灶陽性率稍低于DIE，分析本組病例中盆腔外病灶以腹壁切口內異癥為主，病灶相對較局限，且范圍較小，病例數(shù)不多，故陽性率表達統(tǒng)計學意義不大。進一步分析ZEB1與E-cadherin的關系，結果顯示二者呈負相關（r=-0.447，P<0.001），這個結果與EMT過程中ZEB1抑制E-cadherin的表達機制相吻合。此外，卵巢型內異癥與臨床分期的相關性分析結果顯示，ZEB1蛋白的表達與臨床分期并無相關，推測現(xiàn)行的rAFS分期僅考慮病灶大小、深淺、而并未考慮病變的性質有關。在內異癥的初期，腹膜病灶主要為紅色表淺病灶，但此時腺體和間質結構完整，具備較強的侵襲能力。

綜上所述，ZEB1蛋白在內異癥異位內膜表達顯著升高，以DIE為甚，并與E-cadherin表達呈負相關。提示ZEB1可能通過抑制E-cadherin促進EMT過程，加速病灶的侵襲轉移，在內異癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。聯(lián)合檢測ZEB1和E-cadherin對內異癥的診斷和預后有一定的價值，進一步明確ZEB1誘導的EMT的機制也將有助于為內異癥的靶向治療提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2019-07-01）