鮑茹雪 張懷方 陳 新 鄒枚伶 王文泉③

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇南京210095;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 海南海口571101)

木薯（Manihot esculentaCrantz）是大戟科屬多年生木本作物，主要分布于非洲、東南亞和中南美洲地區(qū)。其塊根產(chǎn)量高且富含淀粉，被譽(yù)為“淀粉之王”。最新資料顯示，木薯已經(jīng)成為全球第四大糧食作物［1］。木薯淀粉除可以直接用于食品和飼料添加外，經(jīng)深加工后所得到的變性淀粉，在生物醫(yī)藥、造紙、紡織、建材和鑄造等領(lǐng)域都有利用，已成為世界公認(rèn)的利用價(jià)值極高的能源與經(jīng)濟(jì)作物。木薯抗旱性突出，耐貧瘠和酸性土壤及其高生物積累特性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于研究熱帶作物的基本生物學(xué)特性具有借鑒意義。

嫁接是一種古老的植物繁殖方式。在人工或自然條件下，通過“接穗”與“砧木”的連接，使嵌合體成長為完整植株，即為嫁接。而影響嫁接成活率的首要因素是品種間的親和性，其中不親和性隨著遺傳距離的增加而逐步變大［2］。嫁接材料自身的生理結(jié)構(gòu)特性和生長活力是影響成活率的另一要素。木本植株，如核桃樹完成維管束組織的修復(fù)需要幾個(gè)月［3］，而草本植物，如擬南芥只需3天［4］。對(duì)于外部影響因素來說，嫁接方法、時(shí)間、溫度等也隨嫁接作物類型而變化。

一直以來，嫁接主要應(yīng)用于提高作物產(chǎn)量、改良植株性狀、減少土肥依賴［5-8］、增強(qiáng)植株抗逆性等方面［9-13］。許多研究者也對(duì)砧木與接穗相互作用的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行了深入研究［14-18］。嫁接技術(shù)在木薯育種工作中，主要致力于增強(qiáng)其對(duì)病蟲害抗性、提高產(chǎn)量和研究內(nèi)在機(jī)制等方面。在抗病蟲害的研究中，利用具有病毒抗性的轉(zhuǎn)基因木薯株系作為砧木進(jìn)行嫁接，所得嵌合體植株顯示出對(duì)木薯褐條病和木薯花葉病極高的抗性，并對(duì)產(chǎn)量的提升有一定幫助［19］。而另一項(xiàng)研究顯示，感染褐條病的接穗可以通過嫁接感染整株木薯，因此選取優(yōu)良性狀的砧木與接穗對(duì)于生產(chǎn)實(shí)踐至關(guān)重要［20］。2011 年， Bomfim 等［21］使 用木 薯品 種Manihot fortalezensis分別嫁接于木薯砧木UnB201和UnB122上，對(duì)塊根進(jìn)行解剖學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)塊根中柱鞘纖維和毒素等顯著減少，而這些解剖結(jié)構(gòu)的變化是由于遺傳物質(zhì)從接穗轉(zhuǎn)移到砧木引起的。

木薯野生型為典型的C3植物，葉片（源器官）的CO2固定率和蔗糖合成率較高，地上部粗壯龐大，而其塊根（庫器官）只積累小部分碳水化合物［22］。但栽培型是一種介于C3和C4的中間型植物，具有高效光合速率和生物能量的儲(chǔ)藏潛力。

本研究通過選取源與庫存在極大差異的木薯種質(zhì)資源：野生型木薯品種W14（Manihot esculentassp.Flabellifolia），栽培品種華南205（SC205）與KU50，獲得盆栽苗后，通過野生木薯與栽培木薯的相互嫁接，對(duì)嫁接技術(shù)與嫁接條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得嫁接嵌合植株，為后續(xù)研究提供重要的研究材料。獲得這種生理性嵌合體植株后，結(jié)合組學(xué)技術(shù)，可以深入研究木薯光合產(chǎn)物運(yùn)輸及塊根形成的源與庫交流信號(hào)，為揭示木薯高生物積累機(jī)理及育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材

選用野生祖先亞種品系W14（Manihot esculentassp.flabellifolia）和栽培木薯品種KU50、華南205（SC205）做相互嫁接處理。W14引種自巴西，主要通過種子繁殖，其莖稈繁殖能力低下，結(jié)薯少且小，產(chǎn)量很低，塊根中干物質(zhì)含量一般在5.0%～8.0%；栽培品種KU50和SC205為東南亞和我國主栽品種，主要以莖稈繁殖為主，塊根富含淀粉，產(chǎn)量高，干物質(zhì)率35.0%～45.0%。所有試驗(yàn)材料取自海南省?？谑谐芜~縣中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所木薯試驗(yàn)基地。

1.2 方法

1.2.1 W14種子處理與種植

打磨W14種壁兩側(cè)至微露子葉，洗凈，清水初篩后，選取活力較好的種子各50顆，分別浸泡于4種不同梯度的激素混合溶液中（NAA與GA3兩者終濃度均分別為0.0、1.0、10.0、100.0 mg/L）。24 h后洗凈，用多菌靈溶液浸泡30 min。蛭石和營養(yǎng)土按1∶3混合，倒入培養(yǎng)缽里，把種子埋入土中，加入清水，27℃左右，保持濕潤。待種子發(fā)芽后，轉(zhuǎn)移到20.0 cm×25.0 cm塑料花盆中，注意澆水及觀察生長狀況。

1.2.2 SC205與KU50種莖繁殖

土與沙子按3∶1比例混合，裝于20.0 cm×25.0 cm的花盆中。收獲的SC205與KU50莖稈，取10.0～12.0 cm作為種莖，保留3～4個(gè)芽點(diǎn)，直插入花盆中，每個(gè)品種30株，放于大棚中正常管理。

1.2.3 芽接

選取健壯、無病蟲害的芽點(diǎn)，用手術(shù)刀自下橫切處貼緊莖稈木質(zhì)部向上削，形成下窄上寬的盾形芽片，即為接穗。在砧木光滑，健康部位，用手術(shù)刀切如“T”型。挑開砧木上“T”字形切口的皮層，將接穗直插入切口。插入接穗的上端切口與“T”字形橫切口對(duì)齊，使用塑料薄膜自上往下從接口上端綁至下端，保證傷口抱緊，而芽點(diǎn)和葉柄留于外側(cè)。每一種莖嫁接2～3個(gè)芽點(diǎn)，以保證其成活率。置于27℃左右的培養(yǎng)房中，暗培養(yǎng)24 h后，逐漸增加光照。在嫁接前3天濕度控制在90%以上，后逐漸降低濕度至正常。接后3～4 d可檢查芽接是否成活。

1.2.4 劈接

嫁接前，向砧木和接穗均勻噴灑純凈水，直至葉片水分滴落為止。去除多余的葉片，用已消毒的嫁接刀將砧木去頂削平，從中間垂直下刀，劈開深至2.0～3.0 cm。選取生長勢旺、健壯無病害的接穗約10.0 cm，將接穗下端兩面對(duì)稱斜切2.0～3.0 cm，形成楔形。接穗插入砧木時(shí)使兩側(cè)的形成層對(duì)準(zhǔn)，用塑料薄膜包扎好接口。置于27℃左右的培養(yǎng)房中，暗培養(yǎng)24 h后，逐漸增加光照。在嫁接前三天濕度控制在90%以上，后逐漸降低濕度至正常。1周后，接穗部分皮色鮮綠，有一定的生長，則移出培養(yǎng)房，置于室外弱光下適應(yīng)外界環(huán)境，并逐漸增加光照。40 d左右，移栽大田。

1.2.5 嫁接苗培養(yǎng)和管理

大田實(shí)踐于熱帶生物技術(shù)研究所海南澄邁木薯試驗(yàn)基地進(jìn)行。采用隨機(jī)區(qū)組田間設(shè)計(jì)，小區(qū)面積15.0 m×3.0 m，每個(gè)品種9株，3次重復(fù)。試∶∶驗(yàn)地土質(zhì)為紅壤土。移栽前深翻30.0～40.0 cm，壟距60.0～70.0 cm，株距30.0～35.0 cm，深挖25.0 cm，用剪刀剪開塑料盆，帶土移栽。統(tǒng)一抽水灌溉，隨后進(jìn)行正規(guī)的田間管理，觀察長勢。根據(jù)實(shí)際生長情況加深排水溝，除草，澆水肥，噴灑農(nóng)藥等。

2 結(jié)果與分析

2.1 W14種子處理與嫁接材料準(zhǔn)備

野生祖先種W14種子在正常情況下不能出芽產(chǎn)生幼苗。通過機(jī)械摩擦至裸露種仁并激素浸泡處理后，篩選出NAA與GA3混合激素溶液濃度為100.0 mg/L時(shí)，W14發(fā)芽率最高（表1）。共得到發(fā)芽種子苗52株，及時(shí)轉(zhuǎn)移到15.0 cm×25.0 cm裝土的塑料花盆中，放于大棚，最終獲得實(shí)生苗47株，隨后進(jìn)行正規(guī)盆栽管理（圖1）。

表1 NAA與GA3激素組合處理后W14種子發(fā)芽數(shù)

2.2 SC205和KU50嫁接材料培養(yǎng)

栽培木薯品種SC205與KU50主要依靠莖稈繁殖，因此選取長度約10.0～12.0 cm且較均一的種莖，每個(gè)種莖保留3～4個(gè)芽眼，每個(gè)品種種植30盆，可保證成活率達(dá)100%，最終SC205成活30株，KU50成活30株（圖1）。

圖1 W14、KU50和SC205嫁接適齡植株形態(tài)

2.3 芽接與劈接方法比較與選擇

本研究采用了芽接與劈接兩種嫁接方法。芽接是選取生長健壯的芽片，嫁接于盆栽苗上。結(jié)果表明芽接后，因芽片失水率較高，容易干枯脫落，成活率最高只有20.0%，而采用劈接法，接穗選取適當(dāng)長度，緩苗輕，在適宜的管理后，成活率在60.0%以上，最高成活率達(dá)87.0%（圖2）。

2.4 劈接法獲得的相互嫁接植株

采用劈接法，對(duì)野生種與栽培種分別進(jìn)行相互嫁接，每個(gè)品種嫁接15株，并對(duì)嫁接后植株的生長過程進(jìn)行觀察（圖3）。最終得到成活的嫁接品種W14/KU50（W14為接穗，KU50為砧木）13株，W14/SC205（W14為接穗，SC205為砧木）11株，KU50/W14（KU50為接穗，W14為砧木）9株，SC205/W14（SC205為接穗，W14為砧木）9株。保留W14、SC205和KU50非嫁接苗各15株作為性狀評(píng)價(jià)對(duì)照材料。

圖2 芽接與劈接的成活率

2.5 嫁接植株的移植與田間管理

嫁接苗適應(yīng)外界環(huán)境后，同對(duì)照植株一起移栽于海南省?？谑谐芜~縣木薯種植基地。每個(gè)品種選取9～12株，按正規(guī)田間試驗(yàn)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，移栽大田，3次重復(fù)。由于10～11月份海南雨水較多，12月至翌年1月溫度持續(xù)降低，移栽苗長勢緩慢，因此需要定期觀察其生長勢，及時(shí)加深排水溝，除草，澆灌水肥，噴灑農(nóng)藥以及搭建保溫棚等。

圖3 野生與栽培木薯相互嫁接植株的生長過程

3 討論

本研究選取的野生型材料為W14，引自于巴西地區(qū)，主要依靠種子進(jìn)行繁殖。但中國境內(nèi)土壤中缺乏分解其種壁的微生物，所以自然條件下種子不能夠出苗。因此需要打磨種壁兩側(cè)，幫助種子破殼。利用激素浸泡，提高其活性。并在種子萌發(fā)期間，保證土壤水分適量及透氣，防止其生蟲或腐爛［22］。

嫁接的接穗與砧木，一般選用性狀優(yōu)良和適應(yīng)力強(qiáng)的品種，同時(shí)必須兼顧兩者的親和性。一般較老或活性較差的接穗或砧木，木質(zhì)部硬化，水分含量低，愈傷組織形成率低，將會(huì)導(dǎo)致嫁接植株成活率大大降低［23］。另有研究表明，自嫁接、同種間嫁接，會(huì)具有好的親和性；同屬之間的嫁接，其親和性有顯著差異；而同科不同屬植株之間，嫁接則基本不親和［8］，這種不親和的內(nèi)在機(jī)制尚不明確。從生理生化角度來說，嫁接不兼容植株，其形成層的愈傷組織分化速度較慢［24-25］，活性氧等應(yīng)激反應(yīng)化合物水平較高，而抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄水平低［26-27］，并且嫁接部位會(huì)產(chǎn)生毒素與淀粉積累等，抑制了嫁接植株的成活與生長。

一般情況下，嫁接方法的選取和嫁接苗的成活率與植株的生理特性、莖稈表型特征以及外界溫度、濕度等有關(guān)［28］。對(duì)于外部影響因素來說，嫁接嵌合部位連接與重建的基礎(chǔ)，即是愈傷組織的形成，因此需要選擇最適溫度；光照在一定程度上抑制愈傷組織的分裂和分化，因此，嫁接前期需適當(dāng)遮陰；嫁接嵌合部位的愈合階段要求保證一定的濕度，為提升成活率，常采用培土、塑料帶綁縛、套袋、涂蠟等措施進(jìn)行保濕。對(duì)于嫁接手法的選擇，要求與植株的莖稈形態(tài)與結(jié)構(gòu)相符，主要分為劈接和芽接兩大類。一般選擇砧木莖稈粗度大于0.4 cm，將有利于提高嫁接成活率［29］。總之，嫁接時(shí)接穗選取適當(dāng)長度，傷口光滑平整，無韌皮液殘留，保證形成層對(duì)準(zhǔn)，在品種兼容的前提下，并給予適宜的管理溫度與濕度，可極大提高嫁接植株的成活率。

通過對(duì)比芽接與劈接兩種嫁接方法發(fā)現(xiàn)，芽接的失敗主要在于芽片水分的喪失。而劈接失敗的主要原因則是由于傷流液在傷口處積累或外界水分透過封口薄膜進(jìn)入傷口，植株從傷口處病變感染，致使嫁接失敗。因此，本研究選取相對(duì)可控的劈接以減少接穗自身因素的限制。鑒于野生品種W14與栽培品種SC205、KU50分屬不同亞種，兩者嫁接的親和性未知，所以嫁接手法與嫁接后管理?xiàng)l件的優(yōu)化異常重要。因此本研究基于木薯莖稈的特征、成活率及手法難易等考慮，選擇60～90 d新生苗，莖稈粗度0.5～1.0 cm，使用劈接作為主要嫁接手段。嫁接后，溫度控制在27℃左右，暗培養(yǎng)24 h后，逐漸增加光照。嫁接前三天濕度控制在90%以上，后逐漸降低濕度至正常，從而使嫁接成活率提升至60.0%以上，甚至是87.0%。

木薯種質(zhì)資源野生祖先種W14與栽培種SC205和KU50，在光合效率及淀粉積累方面存在極大差異。本研究通過野生木薯與栽培木薯的相互嫁接，對(duì)嫁接技術(shù)及嫁接后管理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得嫁接嵌合植株，并把嫁接及對(duì)照植株進(jìn)一步移栽大田，為以后挖掘木薯源、流、庫之間內(nèi)在協(xié)調(diào)機(jī)制做了前期工作，也為接下來的育種工作以及木薯生產(chǎn)提供參考。