秦少杰 劉清媛 唐振寧 劉奇?zhèn)?

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤外三科，寧夏 銀川 750004)

乳腺癌是臨床常見惡性腫瘤，目前乳腺癌發(fā)病率及死亡率逐年升高，已嚴(yán)重威脅人類生命安全，由于內(nèi)分泌系統(tǒng)較為復(fù)雜導(dǎo)致乳腺癌早期診斷較為困難，近年來乳腺癌患者預(yù)后明顯改善，但患者5年生存率仍較低，而術(shù)后乳腺癌細(xì)胞惡性增殖、遷移及侵襲是患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因〔1〕。因而深入探究乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制，積極尋找乳腺癌靶向治療的靶點(diǎn)基因十分重要。微小RNA(miRNA)可通過靶向調(diào)控下游靶基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)控機(jī)體細(xì)胞各種生理病理過程，研究表明miRNA表達(dá)異常可參與多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔2〕。miR-509-3p在頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中表達(dá)量明顯下調(diào)，上調(diào)miR-509-3p表達(dá)可通過調(diào)控表皮生長因子受體(EGFR)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶向基因(MTOR)信號(hào)通路進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖〔3〕。miR-509-3p在肝癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，上調(diào)miR-509-3p表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖及侵襲能力〔4〕。miR-509-3p通過下調(diào)X連鎖凋亡抑制劑而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲〔5〕。但miR-509-3p在乳腺癌致病機(jī)制中的研究尚未見報(bào)道。長鏈非編碼RNA CASC2可通過沉默B淋巴細(xì)胞瘤(BCL)2而增強(qiáng)小檗堿誘導(dǎo)的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞凋亡能力〔6〕。人參皂苷-Rg5通過抑制BCL2表達(dá)進(jìn)而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔7〕。starBase靶基因預(yù)測(cè)出BCL2基因可能是miR-509-3p的靶基因，由此推測(cè)miR-509-3p是否可通過靶向調(diào)控BCL2基因表達(dá)而影響乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡。因此，本研究主要驗(yàn)證上述推測(cè)，為揭示乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集2016年2月至2017年3月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的乳腺癌患者65例為研究對(duì)象，患者均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為乳腺癌，年齡為50～70歲，平均為(65.32±7.16)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：生存時(shí)間超過6個(gè)月；術(shù)前未接受化療或放療等治療；臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者；心肌梗死等心血管疾病病史者；依從性較差者。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情且簽署同意書?；颊呔谛g(shù)中切除乳腺癌組織及癌旁組織并迅速放入液氮中，術(shù)后將其轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2材料與試劑 乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A與乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47D、MDA-MB-231、MDAMB-453、Hs578均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清與胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；miR-509-3p模擬物(mimics)、陰性對(duì)照miR-NC均購自Dharmacon公司(上海睿鉑賽生物科技有限公司代理)；Lipofectamine2000與Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司；Transwell小室購自美國Corning公司；噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Mgteigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對(duì)數(shù)生長期乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，放入不含血清及青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作，將miR-509-3p mimics、miR-NC、anti-miR-509-3p、anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染至乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，分別為miR-509-3p組、miR-NC組、anti-miR-509-3p組、anti-miR-NC組，同時(shí)將pcDNA-BCL2與miR-509-3p mimics共轉(zhuǎn)染至乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，miR-509-3p mimics與pcDNA-BCL2共轉(zhuǎn)染至乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，分別為miR-509-3p+pcDNA-BCL2組、miR-509-3p+pcDNA組，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-509-3p、BCL2 mRNA表達(dá)水平 收集乳腺癌組織及癌旁組織，液氮迅速研磨，加入1 ml Trizol試劑，按照 Trizol法提取組織RNA，(收集各組細(xì)胞采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA)，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書配置qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 2 min循環(huán)1次，(95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s)循環(huán)40次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-509-3p、BCL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長期乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度5×104個(gè)/ml接種于96孔板(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每孔分別加入20 μl MTT溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔，低速振蕩10 min，分別于溶解后的24 h、48 h、72 h時(shí)置于酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔吸光度值(OD)。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌各組對(duì)數(shù)生長期乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，低溫條件下1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min(離心半徑6 cm)，PBS洗滌，再次離心，棄上清，分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC與碘化丙啶(PI)，充分混勻后室溫避孵育20 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲 取100 μl基質(zhì)膠稀釋液(無血清DMEM培養(yǎng)基：基質(zhì)膠=1∶8)鋪于Transwell小室上室，500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入Transwell小室的下室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，擦去未侵入細(xì)胞表面的細(xì)胞，多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫(0.1%)染色10 min，干燥，顯微鏡下拍照并計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取100 μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基放入Transwell小室的上室，另取500 μl含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基加入Transwell小室的下室，其余步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3.6Western印跡檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21、BCL2蛋白表達(dá) 收集各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，加入蛋白裂解液〔1 ml RIPA、1% 苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1% 抑肽酶〕，冰上裂解30 min提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白，取20 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)反應(yīng)，蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗(稀釋比1∶1 000)4℃條件下孵育24 h，TBST洗膜3次，每次5 min，室溫條件下孵育二抗(稀釋比1∶5 000)，孵育時(shí)間1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)劑，用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-509-3p、BCL2 的靶向關(guān)系 starBase預(yù)測(cè)miR-509-3p靶基因可能為BCL2，構(gòu)建含有miR-509-3p與BCL2的結(jié)合位點(diǎn)的野生型載體BCL2-WT，構(gòu)建含有miR-509-3p與BCL2突變結(jié)合位點(diǎn)的突變型載體BCL2-MUT，同時(shí)將乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染分組依據(jù)：BCL2-WT與miR-509-3p mimics共轉(zhuǎn)染；BCL2-WT與miR-NC共轉(zhuǎn)染；BCL2-MUT與miR-509-3p mimics共轉(zhuǎn)染；BCL2-MUT與miR-NC共轉(zhuǎn)染，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別加入細(xì)胞裂解液(60 μl/孔)，低速振蕩20 min，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌組織及細(xì)胞系中miR-509-3p與BCL2的表達(dá) 與癌旁組織相比，乳腺癌組織中miR-509-3p表達(dá)水平顯著降低，而BCL2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；相對(duì)于MCF-10A細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47D、MDA-MB-231、MDAMB-453、Hs578中miR-509-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而BCL2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，其中miR-509-3p在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平降低幅度最顯著，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為研究材料，見表1、表2。

表1 乳腺癌組織中miR-509-3p與BCL2的表達(dá)

表2 乳腺癌細(xì)胞系中miR-509-3p與BCL2的表達(dá)

與MCF-10A相比：1)P<0.05

2.2上調(diào)miR-509-3p表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖及凋亡率的影響 與miR-NC組相比，miR-509-3p組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，CyclinD1蛋白水平明顯降低(P<0.05)，而p21蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖1、圖2、表3。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

1～3：空白對(duì)照組、miR-NC組、miR-509-3p組；圖3同圖2 Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3上調(diào)miR-509-3p表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-509-3p組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 各組細(xì)胞增殖率、凋亡率及遷移、侵襲能力比較

與miR-NC組相比:1)P<0.05

圖3 上調(diào)miR-509-3p表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4miR-509-3p靶向調(diào)控BCL2 starBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-509-3p的靶基因，結(jié)果顯示BCL2的3′UTR中含有與miR-509-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖4。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染miR-NC、BCL2-WT組相比，miR-509-3p mimics與BCL2-WT共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與共轉(zhuǎn)染miR-NC、BCL2-MUT組相比，miR-509-3p mimics與BCL2-MUT共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性變化無顯著性差異(P>0.05)，見表4。進(jìn)一步探究二者間調(diào)控關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC組(0.88±0.12)相比，miR-509-3p組(0.45±0.10)細(xì)胞中BCL2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，相對(duì)于anti-miR-NC組(0.71±0.11)，anti-miR-509-3p組(1.16±0.09)細(xì)胞中BCL2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖5。

圖4 BCL2的3′UTR中含有與miR-509-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

組別BCL2-WTBCL2-MUTmiR-NC組1.03±0.111.08±0.07miR-509-3p組0.43±0.051.07±0.11t/P值14.897/0.0000.230/0.821

2.5BCL2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-509-3p表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用 與miR-509-3p+pcDNA組相比，miR-509-3p+pcDNA-BCL2組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.05)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，MMP-2、CyclinD1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖6、表5。

1～5：miR-NC組、miR-509-3p組、miR-509-3P+pcDNA組、miR-509-3P+pcDNA-BCL2組圖6 Western印跡法檢測(cè)各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 各組細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力比較

與miR-NC組相比:1)P<0.05；與miR-509-3p+pcDNA組相比:2)P<0.05

3 討 論

miRNA異常表達(dá)可參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明miRNA在多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá)，并可通過影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)過程進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔8〕。研究報(bào)道指出miR-940、miR-124等在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可通過抑制靶基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程〔9,10〕。但仍有部分miRNA在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未完全闡明，因此本研究主要尋找新miRNA分子與乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的相關(guān)性，為尋找乳腺癌靶向治療提供潛在靶點(diǎn)基因。

miR-509-3p通過抑制X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖及遷移〔11〕。miR-509-3p可減弱卵巢癌細(xì)胞遷移及增殖能力〔12〕。miR-509-3p通過靶向絲裂原活化蛋白激酶8表達(dá)進(jìn)而抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及遷移〔13〕。既往研究表明 miR-509-3p靶向細(xì)胞周期依賴蛋白激酶(CDK)2、Rac1等多種生長調(diào)節(jié)基因，可能有助于有效的抗癌治療〔14〕。本研究結(jié)果表明乳腺癌組織及細(xì)胞中miR-509-3p的表達(dá)下調(diào)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似，進(jìn)一步研究顯示上調(diào)miR-509-3p表達(dá)可明顯降低乳腺癌細(xì)胞活性，并可減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為驗(yàn)證其作用可能機(jī)制，檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低，而p21表達(dá)水平顯著升高，已有研究報(bào)道指出CyclinD1可通過與CDK4/6結(jié)合形成依賴于細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶(Cyclin-CDK)復(fù)合物進(jìn)而正向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，而p21可通過抑制Cyclin-CDK復(fù)合物形成進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展，抑制細(xì)胞增殖，MMP-2、MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，其可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移〔15，16〕。提示上調(diào)miR-509-3p表達(dá)可通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡過程進(jìn)而參與乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程。

長鏈非編碼(Lnc)RNA H19可通過靶向調(diào)控BCL2基因表達(dá)進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為〔17〕。miR-204過表達(dá)可能通過抑制BCL2基因表達(dá)進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔18〕。BCL2基因表達(dá)異常涉及細(xì)胞增殖、腫瘤形成等多種過程，并可直接影響腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲等生物學(xué)行為〔19，20〕。本研究結(jié)果顯示BCL2在乳腺癌組織及其細(xì)胞中的表達(dá)水平增高，提示BCL2基因表達(dá)水平升高可能促進(jìn)乳腺癌發(fā)生。靶基因預(yù)測(cè)顯示BCL2基因可能是miR-509-3p的靶基因，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明miR-509-3p可靶向結(jié)合BCL2基因并可負(fù)向調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示上調(diào)BCL2基因表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-509-3p過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用及其對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。提示上調(diào)miR-509-3p表達(dá)可通過抑制BCL2基因表達(dá)進(jìn)而減弱乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-509-3p在乳腺癌組織及細(xì)胞中低表達(dá)，而BCL2基因高表達(dá)，上調(diào)miR-509-3p表達(dá)可通過下調(diào)靶基因BCL2表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲并促進(jìn)其凋亡，本研究結(jié)果證實(shí)miR-509-3p在乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，可豐富乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可為臨床乳腺癌基因治療提供潛在靶點(diǎn)。