王雷，劉江，段志超，付雙歲

天津派普大業(yè)儀器科技有限公司，天津市，300400

0 引言

隨著老齡化和亞健康人群增多導(dǎo)致慢性疾病高發(fā)，診斷需求不斷加大。并且我國(guó)醫(yī)療基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)逐漸完善，醫(yī)生更依賴臨床診斷結(jié)果，因此精確的診斷至關(guān)重要?；谖⒘骺孛庖邿晒鈽?biāo)記技術(shù)的臨床診斷具有高靈敏度、高穩(wěn)定性、所需樣本少等優(yōu)點(diǎn)。本文通過(guò)對(duì)免疫熒光技術(shù)和微流控技術(shù)的總結(jié)研究，設(shè)計(jì)研制了一種基于微流控芯片的免疫熒光判讀儀[1]。

1 原理

1.1 微流控免疫熒光技術(shù)原理

免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在激發(fā)光照射下產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的發(fā)射熒光反應(yīng)，并且發(fā)射熒光的光強(qiáng)和結(jié)合物的濃度成正相關(guān)關(guān)系。

微流控免疫熒光芯片，如圖1所示。微流控?zé)晒饧夹g(shù)原理是將待測(cè)樣本液加入微流控芯片的加樣區(qū)后通過(guò)毛細(xì)效應(yīng)自驅(qū)動(dòng)進(jìn)入微流控芯片流道中，與通道中的熒光標(biāo)記抗體形成抗原抗體復(fù)合物，并被預(yù)包被在檢測(cè)T區(qū)和控制C區(qū)的捕獲蛋白捕獲，形成一個(gè)抗原抗體的三明治結(jié)構(gòu)。在激發(fā)光照射下，通過(guò)檢測(cè)發(fā)射熒光的光強(qiáng)就可以得到樣本中待檢測(cè)物的濃度[2-3]。

圖1 微流控免疫熒光芯片F(xiàn)ig.1 Microfluidic immunofluorescence chip

1.2 判讀儀設(shè)計(jì)原理

將待測(cè)樣本液加入微流控芯片的加樣區(qū)后，樣本液通過(guò)毛細(xì)效應(yīng)自驅(qū)動(dòng)進(jìn)入微流控芯片流道中，先通過(guò)標(biāo)記區(qū)與已標(biāo)記熒光色素的抗體（抗原）結(jié)合，然后熒光標(biāo)記結(jié)合物被檢測(cè)T區(qū)和控制C區(qū)的蛋白截獲，剩余液體流入廢液池。判讀儀控制激光發(fā)射模塊發(fā)射激光，檢測(cè)T區(qū)和控制C區(qū)的熒光標(biāo)記結(jié)合物被激發(fā)后發(fā)射熒光，光電檢測(cè)模塊掃描檢測(cè)熒光光強(qiáng)，通過(guò)AD轉(zhuǎn)換后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最后輸出待檢測(cè)樣本液分析結(jié)果。判讀儀工作原理示意圖，如圖2所示。

根據(jù)微流控免疫熒光技術(shù)和判讀儀設(shè)計(jì)原理可知，判讀儀通過(guò)檢測(cè)發(fā)射熒光的光強(qiáng)得到樣本中待檢測(cè)物的濃度，影響檢測(cè)發(fā)射熒光光強(qiáng)的因素有環(huán)境溫度、激發(fā)光功率、激發(fā)光波長(zhǎng)、發(fā)射光濾光片波長(zhǎng)、AD采樣精度等[4-5]。

圖2 判讀儀工作原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of reader working principle

2 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

根據(jù)判讀儀在醫(yī)院使用的應(yīng)用場(chǎng)景，本文設(shè)計(jì)的判讀儀主要功能有：

（1）數(shù)據(jù)采集功能：控制激光發(fā)射、熒光檢測(cè)、控制微流控芯片傳動(dòng)等。

（2）數(shù)據(jù)處理功能：根據(jù)采集的熒光原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理算法得到樣本的檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)。

（3）人機(jī)交互功能：判讀儀的操作界面、顯示檢測(cè)結(jié)果、輸入檢測(cè)項(xiàng)目等信息。

（4）打印報(bào)告功能：打印樣本檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。

（5）數(shù)據(jù)傳輸功能：將判讀儀測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù)傳送到電腦、醫(yī)院LIS系統(tǒng)、云端數(shù)據(jù)處理中心等。

根據(jù)判讀儀主要功能需求，總體設(shè)計(jì)，如圖3所示。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)中下位機(jī)模塊完成數(shù)據(jù)采集功能，上位機(jī)模塊完成數(shù)據(jù)處理、人機(jī)交互、打印報(bào)告、數(shù)據(jù)傳輸?shù)裙δ堋?/p>

圖3 判讀儀的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Fig.3 System structure of reader

2.1 傳感器設(shè)計(jì)

根據(jù)被檢測(cè)熒光標(biāo)記物的固有特性，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的激光發(fā)射波長(zhǎng)和發(fā)射熒光濾光片波長(zhǎng)，可以減小其它無(wú)關(guān)光波噪聲，提高準(zhǔn)確性和靈敏度。凸透鏡可以聚集放射熒光，提高發(fā)射熒光的光強(qiáng)。光電傳感器選擇日本濱松高靈敏度光電二極管。傳感器結(jié)構(gòu)，如圖4所示。

圖4 傳感器結(jié)構(gòu)Fig.4 Sensor structure

2.2 硬件設(shè)計(jì)

上位機(jī)模塊控制器選用深圳市新移科技有限公司的XY8901控制模塊，該模塊基于高通平臺(tái)，可以運(yùn)行安卓操作系統(tǒng)，具有易于開(kāi)發(fā)操控界面和豐富的控制接口等優(yōu)點(diǎn)。

下位機(jī)模塊控制器選用STM32F103，光電傳感器選用高精度的日本濱松光電倍增管，確保判讀結(jié)果精度。

2.3 軟件與算法設(shè)計(jì)

判讀儀首先通過(guò)控制光電轉(zhuǎn)換模塊掃描微流控芯片，獲得熒光強(qiáng)度的原始數(shù)據(jù)；然后將數(shù)據(jù)進(jìn)行濾波處理，減小噪聲干擾，平滑熒光光強(qiáng)數(shù)據(jù)曲線；平滑后的熒光光強(qiáng)數(shù)據(jù)曲線通過(guò)尋峰、背景扣除、峰面積積分等得到峰面積比值T/C。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣本的不同濃度序列和對(duì)應(yīng)的峰面積比值T/C得到樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線。待檢測(cè)樣品時(shí)，通過(guò)樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線和峰面積比值T/C就可以得到待檢測(cè)樣品的濃度。

（1）濾波算法

Savitzky-Golay平滑濾波器作為一種低通濾波器，廣泛用于平滑噪聲數(shù)據(jù)，是一種在時(shí)域內(nèi)基于多項(xiàng)式，通過(guò)移動(dòng)窗口利用最小二乘法進(jìn)行最佳擬合的方法。其最大特點(diǎn)在于濾除噪聲的同時(shí)可確保信號(hào)的形狀、寬度不變，相比于其它滑動(dòng)平均算法更能保留信號(hào)相對(duì)極大值、極小值和寬帶等分布特性。圖5為光電傳感器輸出的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)平滑濾波器后的圖形[6]。

（2）尋峰算法

數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾波算法處理后，熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)曲線呈現(xiàn)明顯的峰特征。首先計(jì)算數(shù)據(jù)曲線的一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)，如圖6所示。可知在曲線峰特征區(qū)域一階導(dǎo)數(shù)的最大值和最小值分別為峰兩側(cè)急劇變化的中心，所以尋峰算法如下：①計(jì)算原始曲線的一階導(dǎo)數(shù)；②根據(jù)一階導(dǎo)數(shù)曲線確定峰兩邊的中心位置；③從峰兩邊的中心位置開(kāi)始向兩邊，逐點(diǎn)尋找一階導(dǎo)數(shù)大于某一設(shè)定閾值的點(diǎn)位置，則該點(diǎn)即為峰的起始點(diǎn)或終止點(diǎn)。

圖5 濾波處理Fig.5 Filtering processing

圖6 尋峰處理Fig.6 Find peak processing

（3）峰面積比值T/C確定了峰起始點(diǎn)和終止點(diǎn)后，分別計(jì)算峰曲線T和峰曲線C起始點(diǎn)和終止點(diǎn)附近（不含峰）的背景基準(zhǔn)平均值。然后對(duì)起始點(diǎn)和終止點(diǎn)之間的峰曲線進(jìn)行面積積分，然后減去背景基準(zhǔn)平均值以下的面積，得到峰曲線面積T和峰曲線面積C。最后得到峰面積比值T/C。

（4）標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線生成

取9種標(biāo)準(zhǔn)濃度的樣品液和同一批次的微流控芯片，在微流控芯片上依次加樣標(biāo)準(zhǔn)濃度的樣品液后，用判讀儀測(cè)試并記錄峰面積比值T/C。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品液濃度和對(duì)應(yīng)的峰面積比值T/C，用最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，得到這一批次微流控芯片板的標(biāo)定曲線和參數(shù)。

（5）軟件程序流程

項(xiàng)目樣本檢測(cè)前如果沒(méi)有保存項(xiàng)目參數(shù)，需要首先進(jìn)行項(xiàng)目參數(shù)的設(shè)定，然后測(cè)試，如圖7所示。

圖7 程序流程圖Fig.7 Program flow chart

3 實(shí)驗(yàn)

3.1 準(zhǔn)確性

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模号凶x儀對(duì)總前列腺特異性抗原（PSA）樣品液標(biāo)準(zhǔn)濃度的準(zhǔn)確性。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：韓國(guó)NanoEnTek公司的總前列腺特異性抗原試劑（微流控免疫熒光法）以及該項(xiàng)目批次的標(biāo)定曲線和參數(shù)，PSA高濃度（34 ng/mL）的標(biāo)準(zhǔn)樣品，加樣槍，韓國(guó)NanoEnTek公司的微流控?zé)晒馀凶x儀等。

實(shí)驗(yàn)溫度：室溫。

實(shí)驗(yàn)步驟：

（1）PSA高濃度（34 ng/mL）的標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋成11種梯度濃度待檢測(cè)液（0.10,3.49,6.88,10.27,13.66,17.05,20.44,23.83,27.22,30.61,34.00）ng/mL。

（2）依次對(duì)每種濃度PSA 樣品液使用本文研制的判讀儀和韓國(guó)NanoEnTek公司的判讀儀進(jìn)行3次判讀并記錄計(jì)算3次的平均值。

（3）根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算相對(duì)誤差。得到低濃度0.1 ng/mL相對(duì)誤差為8%，判讀儀的相對(duì)誤差均小于5%。

（4）計(jì)算判讀儀與NanoEnTek判讀儀的相關(guān)系數(shù)為0.998 8。

3.2 重復(fù)性

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模号凶x儀總前列腺特異性抗原（PSA）樣品液標(biāo)準(zhǔn)濃度的重復(fù)性。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：濃度為（3.49，13.66，20.44，30.61）ng/mL的PSA標(biāo)準(zhǔn)樣品液，韓國(guó)NanoEnTek公司的總前列腺特異性抗原試劑（微流控免疫熒光法）等。

實(shí)驗(yàn)溫度：室溫。

實(shí)驗(yàn)步驟：

（1）依次對(duì)4組不同濃度的PSA標(biāo)準(zhǔn)樣品液使用判讀儀進(jìn)行判讀并記錄；

（2）重復(fù)步驟10次；

（3）計(jì)算變異系數(shù)CV值，如式（1）所示，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)判讀儀的變異系數(shù)不超過(guò)5%。

表1 變異系數(shù)計(jì)算結(jié)果Tab.1 Result of CV

4 討論

本文研制的微流控免疫熒光判讀儀在常溫下的準(zhǔn)確性和重復(fù)性具有和韓國(guó)NanoEnTek公司判讀儀相同的性能。將微流控技術(shù)和免疫熒光技術(shù)相結(jié)合的微流控免疫熒光技術(shù)具有高靈敏度、高穩(wěn)定性、所需樣本少等優(yōu)點(diǎn)，而我國(guó)目前與國(guó)外先進(jìn)技術(shù)還存在一定的差距。本文設(shè)計(jì)研制的微流控技術(shù)免疫熒光判讀儀相比于國(guó)外進(jìn)口儀器具有良好的精確度和重復(fù)性，能夠幫助國(guó)內(nèi)微流控芯片試劑廠商完成試劑質(zhì)控和臨床應(yīng)用，推廣促進(jìn)我國(guó)微流控免疫熒光技術(shù)的發(fā)展。