袁明銘 周靜 侯開領(lǐng)

摘要：為了研究食源性肥胖小鼠腹部脂肪組織中IRX3基因5′UTR區(qū)甲基化情況及IRX3基因mRNA表達情況，將雄性C57BL/6J小鼠進行食源性肥胖造模，采用RT-qPCR法檢測IRX3 mRNA表達情況，BSP （Bisulfite sequencing PCR，BSP）法檢測IRX3基因5′UTR區(qū)甲基化情況。結(jié)果表明，肥胖組小鼠腹部脂肪組織IRX3基因相對表達量極顯著高于對照組（P<0.01）;小鼠腹部脂肪組織IRX3基因5′UTR區(qū)甲基化率差異不顯著，但有2個位點（-128 bp和-116 bp處）和1個位點（-182 bp處）的甲基化率在所有肥胖小鼠中分別達到62.5%、62.5%和75.0%，極顯著高于其他位點。小鼠發(fā)生食源性肥胖，IRX3基因mRNA表達上調(diào);食源性肥胖小鼠腹部脂肪組織IRX3基因表達上調(diào)與其5′UTR區(qū)甲基化率無關(guān);食源性肥胖小鼠腹部脂肪組織IRX3基因5′UTR區(qū)3個特異位點的甲基化，可能參與了肥胖的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：食源性肥胖;IRX3基因;相對表達量;5′UTR;甲基化

中圖分類號：Q7? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）20-0170-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.041? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Research on IRX3 5′UTR methylation rate in food-induced

obese mice abdominal adipose

YUAN Ming-ming，ZHOU Jing，HOU Kai-ling

（Sichuan Academy of Chinese Medicin Sciences，Chengdu 610041，China）

Abstract： To investigate the IRX3 gene expression levels and the 5′UTR methylation rate in food-induced obese mice abdominal adipose， male obese C57BL/6J mice model was induced by feeding high-fat diet， RT-qPCR was used to detect the IRX3 expression levels and BSP was used to detect the 5′UTR methylation status. Results showed that Obese mice model was established successfully. Expression levels in obese mice were higher than normal controls（P<0.01）. The 5′UTR methylation rate had no significant difference in the two groups of mice， but the methylation rate in 2 loci（-128 bp and -116 bp） and 1 locus （-182 bp） were 62.5%， 62.5% and 75.0% respectively， all higher than other loci significantly. The IRX3 mRNA expression is up-regulated in food-induced obese mice. The IRX3 mRNA expression levels has nothing to do with its 5′UTR methylation rate. The methylation in 3 specific loci may be associated with obesity.

Key words： food-induced obesity; IRX3 gene; relative expression; 5′UTR; methylation

肥胖已成為全世界范圍內(nèi)一個越來越令人關(guān)注的問題。隨著肥胖患病率的增高，與其相關(guān)的慢性非傳染性疾病如糖尿病、高血壓、心腦血管疾病等的患病率也呈明顯的增加趨勢。肥胖是在基因和環(huán)境因素共同作用下的結(jié)果，其發(fā)病機制的研究取得了一定的進展，但目前治療沒有突破，進一步探索肥胖的發(fā)病機制可為其治療帶來希望[1，2]。

IRX3基因是Iroquois同源盒基因家族的成員之一，具有較高的保守性，是調(diào)節(jié)脊索動物脂肪沉積的重要基因。有研究發(fā)現(xiàn)，IRX3是調(diào)控脂肪組織的重要因子，并對脂肪沉積有重要影響[3-6]。McMurray等[7]在驗證IRX3基因的作用時發(fā)現(xiàn)，IRX3基因敲除的小鼠基礎(chǔ)代謝增強、能量消耗水平高、體重明顯下降，具體表現(xiàn)為脂肪組織的減少以及脂肪細胞尺寸的變小。

關(guān)于IRX3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)甲基化程度與肥胖的關(guān)系目前報道較少，因此本研究針對IRX3基因5′UTR區(qū)甲基化程度與肥胖之間的關(guān)系進行研究，以期從表觀遺傳角度探討肥胖發(fā)胖機制。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗動物與高脂飼料? 3周齡SPF級健康雄性C57BL/6J小鼠30只，體質(zhì)量13～15 g，四川大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-026，SPF級屏障飼養(yǎng)系統(tǒng)室溫21～23 ℃，自然光照，自由進食進水;高脂飼料，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，產(chǎn)品號H10060。

1.1.2? 主要試劑? Prime STAR HS（Premix），購自寶生物工程（大連）有限公司;重亞硫酸鹽修飾試劑盒、RNA抽提試劑盒、DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、克隆試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、cDNA合成試劑盒、qPCR SYBR Green試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司;Separation Buffer、Size Marker、Alignment Marker均購自Bioptic公司。

1.2? 方法

1.2.1? 小鼠肥胖造模? 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為普通飼料喂養(yǎng)組10只（對照組），高脂喂養(yǎng)組20只（肥胖組）。每周稱體質(zhì)量，共造模12周。肥胖組質(zhì)量≥對照組質(zhì)量×120%，視為肥胖造模成功。

1.2.2? 樣本采集及計算? 小鼠飼養(yǎng)12周后空腹稱體質(zhì)量，摘眼球取血，隨即脫頸處死，迅速解剖分離腹腔內(nèi)脂肪組織（腸系膜脂肪、腎周脂肪、附睪脂肪墊）并稱重，隨即置于液氮罐，試驗結(jié)束后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。腹腔?nèi)脂肪量=腸系膜脂肪+腎周脂肪+附睪脂肪墊，計算腹腔脂肪量/體質(zhì)量比值。

1.2.3? RT-qPCR檢測IRX3 mRNA相對表達量? 對照組和肥胖組各選取6個樣，按試劑盒操作抽提RNA和合成cDNA第一鏈。擴增IRX3基因與36b4基因引物序列見表1，按照試劑盒內(nèi)說明書配制反應(yīng)體系，在ABI Stepone儀器上進行反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40次，采用2-ΔΔCt計算IRX3 mRNA相對表達量。

1.2.4? BSP法檢測IRX3基因5′UTR區(qū)甲基化? 選取小鼠IRX3基因（GenBank登錄號：16373）5′UTR區(qū)，共414 bp，包含48個可被甲基化胞嘧啶位點，位點如圖1所示。

按試劑盒操作抽提小鼠腹部脂肪組織DNA，利用重亞硫酸鹽修飾試劑盒對抽提的DNA進行修飾，并純化，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用MethPrimer網(wǎng)站和Methyl Primer Express v1.0軟件設(shè)計2對引物，PCR純化產(chǎn)物連接到pUC18-T載體，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，選取陽性克隆，提取質(zhì)粒，送檢測序。引物合成和測序均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，引物見表2。

1.2.5? 統(tǒng)計學(xué)方法? 利用SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”表示。組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 大鼠體質(zhì)量、腹腔脂肪量

淘汰體質(zhì)量不合格、受傷、狀態(tài)低迷等小鼠，最終選取8只作為肥胖小鼠，對照組同樣選取8只。所選8只肥胖組小鼠體質(zhì)量≥對照組質(zhì)量×120%，造模成功，且體質(zhì)量、腹腔脂肪質(zhì)量及兩者比值均極顯著高于對照組小鼠，結(jié)果如表3所示。

2.2? RT-qPCR法檢測IRX3 mRNA相對表達量

目的基因IRX3和內(nèi)參基因36b4的擴增曲線，溶解曲線如圖2a和圖2b所示，擴增曲線平滑，基因擴增特異性強，符合試驗要求。兩組小鼠腹部脂肪組織IRX3基因相對表達量見圖2c和表4，肥胖組極顯著高于對照組。

2.3? 兩組大鼠腹部脂肪組織IRX3基因5′UTR區(qū)甲基化情況比較

對照組和肥胖組大鼠腹部脂肪組織IRX3基因啟動子區(qū)均有48個位點可被甲基化，見圖3。對照組甲基化率為（3.91±2.84）%，肥胖組甲基化率為（5.21±2.08）%，P=0.34，差異不顯著。但如圖3黑色方框中所示，IRX3基因起始密碼子ATG上游-182 bp處胞嘧啶的甲基化率在肥胖組中達到75.0%，-128 bp和-116 bp處胞嘧啶的甲基化率在肥胖組中均達到62.5%，極顯著高于其他位點，且3處位點在對照組小鼠的IRX3基因中均未甲基化。因此，推測位于IRX3基因5′UTR的此3個位點的甲基化可能與肥胖的發(fā)生有關(guān)。

3? 討論

IRX3基因敲除的小鼠能完全抵抗高脂飲食（High-fat diet，HFD），在葡萄糖耐量試驗（Glucose tolerence tests，GTT）和胰島素耐量試驗（Insulin tolerence test，ITT）中，GTT 并無顯著差異，說明 IRX3 基因敲除的小鼠具備更好的能力來處理葡萄糖[8]。IRX3基因與肥胖的發(fā)生相關(guān)。肥胖的發(fā)病機制仍未闡明，近年研究顯示表觀遺傳可能參與了肥胖的發(fā)生發(fā)展。目前，關(guān)于IRX3基因的表觀修飾與肥胖的關(guān)系報道較少，本研究則從表觀遺傳角度研究IRX3基因甲基化與肥胖的關(guān)系，力求為闡明肥胖機制提供基礎(chǔ)研究。

DNA甲基化是指CpG位點的胞嘧啶被甲基所修飾，從而在不改變基因結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。一般來講，低甲基化可促進基因的表達，而高甲基化則能抑制基因表達。研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象及穩(wěn)定性、DNA與轉(zhuǎn)錄因子等蛋白相互作用方式的改變，從而控制基因表達[9，10]。

本研究中食源性肥胖引起IRX3基因表達上調(diào)，其5′UTR區(qū)的甲基化率并未明顯改變，可能的原因有：①IRX3基因的表達上調(diào)與其啟動子其他區(qū)域的甲基化程度相關(guān);②遠端與肥胖相關(guān)的調(diào)控元件與IRX3基因啟動子通過物理連接的方式發(fā)生互作;③IRX3基因發(fā)生SNP，導(dǎo)致基因表達上調(diào);④受肥胖相關(guān)通路上的其他基因調(diào)控等[11，12]。

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