姚 宜 張安瑩 韓 蓓

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院暨湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院耳鼻喉科，宜昌市 443003，電子郵箱：cnmd6032@163.com)

分泌性中耳炎是耳鼻咽喉科的常見(jiàn)疾病，部分患者的慢性炎癥遷延不愈，造成中耳炎局部組織的細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生重塑，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)鄰近骨破壞、角化細(xì)胞凋亡[1-2]。蛋白酶活性的改變是造成細(xì)胞外基質(zhì)異常水解、過(guò)度重塑的重要環(huán)節(jié)[3]，但具體的調(diào)控機(jī)制仍未完全明確。伴有Kazal基序富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白(reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs，RECK)是一類抑癌基因，通過(guò)抑制蛋白酶活性來(lái)促使細(xì)胞外基質(zhì)降解、骨基質(zhì)破壞、細(xì)胞凋亡[4]。本研究探討分泌性中耳炎病灶組織中RECK表達(dá)情況及其與細(xì)胞外基質(zhì)重塑、骨破壞及細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。

1 資料及方法

1.1 臨床資料 選擇2015年3月至2017年4月在我院進(jìn)行開放式乳突改良根治手術(shù)或完壁式乳突根治手術(shù)的58例分泌性中耳炎患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中耳炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)符合手術(shù)指征；(3)臨床資料完整；(4)手術(shù)切除的中耳炎病灶組織保留完整。排除標(biāo)準(zhǔn)(1)合并耳部其他病變者；(2)合并惡性腫瘤、全身性骨病者。其中男性31例、女性27例，年齡36～58(48.92±8.21)歲。另取同期因外傷在我院行外耳道成形術(shù)的患者44例，均無(wú)耳部其他病變及感染，其中男性24例、女性20例，年齡43～59(49.28±10.28)歲，手術(shù)后留取正常外耳道上皮組織。分泌性中耳炎患者和外耳道成形術(shù)患者的性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄：取適量分泌性中耳炎病灶黏膜上皮組織和正常外耳道上皮組織，加入Trizol裂解液后充分研磨組織，研磨得到的組織液在離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司，型號(hào)：micro21R)中以12 000 r/min的速度離心5 min，取上層澄清液體，按照RNA提取試劑盒(北京天根公司，批號(hào)：DP431)的說(shuō)明書提取總RNA。分離得到RNA后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根公司，批號(hào)：KR118)的說(shuō)明書合成cDNA。

1.2.2 mRNA表達(dá)量的檢測(cè)：檢測(cè)以下指標(biāo)的mRNA表達(dá)量，包括RECK、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、Smad 2/3、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)1、TIMP 2、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX 2)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κ B，RANK)、RANK配體(RANK ligand，RANKL)、第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteine aspartic auc specific proteinase 3，Caspase-3)、Livin、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)。取cDNA樣本，按照PCR反應(yīng)試劑盒(上海天根公司，批號(hào)：FP209)說(shuō)明書配置PCR反應(yīng)體系，包括cDNA 1 μL、試劑盒內(nèi)的反應(yīng)混合液10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、去離子水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min，95℃ 15 s，各基因特異性退火溫度20 s，72℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)。儀器為CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司)；在儀器自帶的軟件中自動(dòng)生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以β-actin為內(nèi)參，按照公式2-△△Ct計(jì)算相應(yīng)基因的mRNA表達(dá)量。引物由上海生工公司合成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種組織中RECK mRNA的表達(dá)情況 分泌性中耳炎病灶組織中RECK的mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.47±0.07，正常外耳道上皮組織中RECK的mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.04±0.18。分泌性中耳炎病灶組織中RECK相對(duì)的mRNA表達(dá)量低于正常外耳道上皮組織(t=19.895，P<0.001)。

2.2 兩種組織中細(xì)胞外基質(zhì)重塑分子的mRNA表達(dá)情況 分泌性中耳炎病灶組織中MMP 2、TGF-β1、Smad 2/3的mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常外耳道上皮組織，而TIMP 1、TIMP 2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于正常外耳道上皮組織(均P<0.05)，見(jiàn)表1。分泌性中耳炎病灶組織中RECK mRNA相對(duì)表達(dá)量與MMP 2、TGF-β1、Smad 2/3 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.324、-0.291、-0.236，P=0.008、0.013、0.022)，與TIMP 1、TIMP 2 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.288、0.382，P=0.014、0.001)

表1 兩種組織中細(xì)胞外基質(zhì)重塑分子mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

2.3 兩種組織中骨破壞分子mRNA的表達(dá)情況 分泌性中耳炎病灶組織中RUNX 2、OPG的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于正常外耳道上皮組織，而RANK、RANKL的mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常外耳道上皮組織(均P<0.05)，見(jiàn)表2。分泌性中耳炎病灶組織中RECK的mRNA相對(duì)表達(dá)量與RUNX 2、OPG的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.293、0.231，P=0.018、0.024)，與RANK、RANKL的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.212、-0.308，P=0.030、0.011)。

表2 兩種組織中骨破壞分子mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

2.4 兩種組織中細(xì)胞凋亡基因mRNA的表達(dá)情況 分泌性中耳炎病灶組織中PTEN、Caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常外耳道上皮組織，而Livin、Cyclin D1、PCNA的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于正常外耳道上皮組織(P<0.05)，見(jiàn)表3。分泌性中耳炎病灶組織中RECK的mRNA相對(duì)表達(dá)量與PTEN、Caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.393，P<0.001；r=-0.198，P=0.039)，與Livin、Cyclin D1、PCNA的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.282，P=0.018；r=0.341，P=0.002；r=0.387，P<0.001)。

表3 兩種組織中細(xì)胞凋亡基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

3 討 論

分泌性中耳炎遷延不愈為慢性疾病后會(huì)導(dǎo)致炎癥周圍組織發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)重塑，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)鄰近骨質(zhì)的破壞以及角化細(xì)胞的凋亡。其中，骨質(zhì)破壞不僅會(huì)影響聽(tīng)骨鏈的功能并造成患者聽(tīng)力損害，還會(huì)促進(jìn)慢性炎癥對(duì)顱底骨質(zhì)的破壞，并增加顱內(nèi)感染等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生概率；而角化細(xì)胞的凋亡則會(huì)造成中耳局部角化碎屑堆積并影響聽(tīng)力[6-7]。蛋白酶活性的改變是造成細(xì)胞外基質(zhì)異常水解、過(guò)度重塑的重要病理環(huán)節(jié)，也能對(duì)骨基質(zhì)進(jìn)行水解并造成骨破壞[8]。目前，關(guān)于分泌性中耳炎局部組織中蛋白酶活性改變的調(diào)控機(jī)制仍未完全明確。RECK是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制分子，其能夠直接降低蛋白酶的水解活性，同時(shí)也能阻礙蛋白酶在局部組織的錨定，并抑制蛋白酶的水解活性[9-10]。本研究結(jié)果顯示，分泌性中耳炎病灶組織中RECK mRNA的表達(dá)量低于正常外耳道上皮組織(P<0.05)，這說(shuō)明RECK的低表達(dá)與分泌性中耳炎的發(fā)生存在密切關(guān)系。結(jié)合RECK的生物學(xué)活性，我們推測(cè)RECK的低表達(dá)能夠使蛋白酶活性增加，進(jìn)而促進(jìn)中耳炎局部組織發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)重塑以及骨質(zhì)破壞。

分泌性中耳炎局部組織的重塑依賴于多種蛋白酶及細(xì)胞因子的生物學(xué)活性，其中MMP 2是具有強(qiáng)大水解作用的MMP，能夠使細(xì)胞間基質(zhì)內(nèi)的彈性蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白均發(fā)生過(guò)度水解，進(jìn)而促進(jìn)了組織重塑的過(guò)程[11]；TIMP 1和TIMP 2則是MMP的特異性抑制分子，通過(guò)與MMP 2形成共價(jià)結(jié)合后降低其水解活性，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑過(guò)程產(chǎn)生抑制作用[12-13]。TGF-β1是介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)重塑關(guān)鍵的細(xì)胞因子，能夠通過(guò)Smad 2/3進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生異常沉積，加劇了組織重塑[14]。本研究結(jié)果顯示，分泌性中耳炎病灶組織中MMP 2、TGF-β1、Smad 2/3 mRNA的表達(dá)量均高于正常外耳道上皮組織，而TIMP 1、TIMP 2 mRNA的表達(dá)量均低于正常外耳道上皮組織(均P<0.05)。這說(shuō)明細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)分子的高表達(dá)、抑制分子的低表達(dá)與分泌性中耳炎的發(fā)生密切相關(guān)。此外，分泌性中耳炎病灶組織中RECK mRNA的表達(dá)量與MMP 2、TGF-β1、Smad 2/3 mRNA的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，與TIMP 1、TIMP 2 mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)(均P<0.05)。這提示分泌性中耳炎患者局部組織中低表達(dá)的RECK能夠增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)分子的活性，抑制細(xì)胞外基質(zhì)重塑抑制分子的活性，進(jìn)而在分泌性中耳炎發(fā)展過(guò)程中促進(jìn)局部組織的細(xì)胞外基質(zhì)重塑。

分泌性中耳炎局部組織發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)重塑會(huì)進(jìn)一步造成炎癥擴(kuò)散并引起骨質(zhì)破壞，蛋白酶水解活性的增加會(huì)直接破壞骨基質(zhì)內(nèi)的膠原成分，同時(shí)也會(huì)影響成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的活性[15]。成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成以及破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，在骨質(zhì)完整性的調(diào)控中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用：當(dāng)破骨細(xì)胞活性超過(guò)成骨細(xì)胞時(shí)，骨吸收過(guò)程強(qiáng)于骨形成過(guò)程，從而造成了骨質(zhì)破壞。RUNX 2是調(diào)控成骨細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)多種成骨標(biāo)志基因的表達(dá)并促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。OPG/RANKL/RANK是調(diào)控成骨/破骨平衡的通路，其中RANKL是破骨細(xì)胞表面受體RANK的配體，兩者結(jié)合后能夠通過(guò)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性；OPG是成骨細(xì)胞分泌的活性蛋白，能夠與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK并阻礙破骨細(xì)胞的活化[16-17]。本研究結(jié)果顯示，分泌性中耳炎病灶組織中RUNX 2、OPG mRNA的表達(dá)量低于正常外耳道上皮組織，而RANK、RANKL mRNA的表達(dá)量均高于正常外耳道上皮組織(均P<0.05)。這說(shuō)明成骨細(xì)胞標(biāo)志分子的低表達(dá)、破骨細(xì)胞標(biāo)志分子的高表達(dá)與分泌性中耳炎的發(fā)生密切相關(guān)。此外，分泌性中耳炎病灶組織中RECK mRNA的表達(dá)量與RUNX 2、OPG mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)，與RANK、RANKL的mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。這提示分泌性中耳炎局部組織中RECK的低表達(dá)能夠抑制成骨細(xì)胞活性、增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，進(jìn)而促進(jìn)了骨破壞。

在分泌性中耳炎的發(fā)展過(guò)程中，局部炎癥的擴(kuò)散還會(huì)造成鄰近的角化細(xì)胞損傷及脫落，進(jìn)而造成中耳腔內(nèi)大量角化鱗屑堆積。細(xì)胞凋亡是造成角化細(xì)胞損傷的重要病理環(huán)節(jié)，該環(huán)節(jié)受到多種促凋亡基因及凋亡抑制基因的調(diào)控。PTEN是重要的促凋亡基因，具有磷酸酶活性，能夠使細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路中的多種信號(hào)分子去磷酸化，進(jìn)而降低信號(hào)通路的活性，并阻礙細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。Livin是具有廣泛凋亡抑制活性的分子，能夠阻礙凋亡級(jí)聯(lián)激活通路中多種分子的激活，進(jìn)而抑制Caspase-3的激活及其所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Cyclin D1和PCAN是在細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮正性調(diào)控作用的分子，前者能夠加速細(xì)胞周期，而后者能夠加速DNA復(fù)制，兩者通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制。本研究結(jié)果顯示，分泌性中耳炎病灶組織中PTEN、Caspase-3 mRNA的表達(dá)量均高于正常外耳道上皮組織，而Livin、Cyclin D1、PCNA mRNA的表達(dá)量均低于正常外耳道上皮組織(均P<0.05)。這說(shuō)明促凋亡基因的高表達(dá)、凋亡抑制基因的低表達(dá)與分泌性中耳炎的發(fā)生密切相關(guān)。此外，分泌性中耳炎病灶組織中RECK mRNA的表達(dá)量與PTEN、Caspase-3 mRNA的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，與Livin、Cyclin D1、PCNA mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)(均P<0.05)。表明分泌性中耳炎病灶組織中低表達(dá)的RECK能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，分泌性中耳炎病灶組織中RECK呈低表達(dá)，而這或可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑、骨質(zhì)破壞及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。