高卓維,黃華聰,潘斯敏,林清,梁澄照,符路娣

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤，具有起病隱匿，入侵快，預(yù)后差，死亡率高的特點[1]。目前對于不能手術(shù)切除的患者的姑息治療方法，如化療和放療，均有嚴重的不良反應(yīng)和不同程度的耐藥性[2]。臨床實踐表明肝癌細胞對化學(xué)治療藥物的敏感性低于許多其他癌癥，常出現(xiàn)多重耐藥(Multi-drug resistance, MDR)，其特點是腫瘤細胞的耐藥性不僅針對特定藥物，而是包括其它具有不同結(jié)構(gòu)和作用機制的藥物[3]。抗癌Ⅰ號方為廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院治療腫瘤的院內(nèi)制劑，具有益氣養(yǎng)陰、化瘀解毒的功效。臨床上初步發(fā)現(xiàn)該方對肝癌患者增強機體免疫功能、與化療合用協(xié)同增效及改善提高生存質(zhì)量等多方面有一定的作用。本研究將在體外實驗探討抗癌Ⅰ號方對耐藥肝癌細胞的逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠購買自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(動物許可證號：SCXK粵2018-0002)。于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房飼養(yǎng)，提供清潔的飼料、飲用水以及晝夜各12 h的規(guī)律光照。動物實驗通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查。

1.2 實驗藥物

實驗所用抗癌Ⅰ號方(主要成分：靈芝、鐵皮石斛、白花蛇舌草、藤梨根，輔料為蜂蜜)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院藥劑科供。P-gp和β-actin的抗體購自美國CST公司。BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶與磷酸酶抑制劑、RIPA細胞裂解液購買自碧云天生物科技有限公司。PVDF膜、ECL發(fā)光液購買自Millipore公司。MTT購買自美國SIGMA公司。

1.3 實驗器材

BIO-RAD電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購買自美國伯樂太平洋有限公司，曝光機為KODAK 全光譜多功能活體成像系統(tǒng)、酶標儀購買自美國SIGMA公司，MICROMAX高速離心機購買自賽默飛世爾科技公司。

1.4 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株BEL-7402和人肝癌耐5-Fu(5-氟尿嘧啶)細胞株BEL-7402/5-Fu購自南京凱基生物公司。BEL-7402/5-Fu 用Gibco RPMI1640完全培養(yǎng)基，并含5-Fu的培養(yǎng)液中維持其耐藥性，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。BEL-7402/5-Fu細胞株具有MDR, 可能與細胞內(nèi)胸苷酸合酶和ABC轉(zhuǎn)運蛋白等機制相關(guān), 是研究MDR逆轉(zhuǎn)劑的良好模型, 故選擇該細胞株為研究模型。

1.5 含藥血清制備

Wistar大鼠30只按2∶1的比例隨機分為實驗組與正常組，根據(jù)大鼠體重按1 mL/100 g分別進行灌胃，實驗組給予抗癌Ⅰ號方，正常對照組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃30 d。最后1次灌胃2 h后，10%水合氯醛麻醉, 心臟采血，離心分離血清。將每組大鼠血清分別混合、72 ℃滅活30 min、除菌過濾后置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MTT法檢測抗癌Ⅰ號方對BEL7402/5-Fu細胞活力的影響

通過MTT法檢測5-Fu和抗癌Ⅰ號方含藥血清對BEL7402/5-Fu細胞活力的影響。將收集的細胞(5×103個/mL)加入在96孔板中，并加入不同濃度的5-Fu和抗癌Ⅰ號方含藥血清培養(yǎng)24 h或48 h。然后棄培養(yǎng)基，加入10 μL MTT溶液(0.5 mg/mL，PBS溶解)到每個孔中。 在37 ℃孵育4 h后，棄MTT加入200 μL DMSO，避光孵育10 min后通過酶標儀在490 nm波長測量OD值。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞羅丹明123含量

化學(xué)治療藥物從腫瘤細胞流入周圍組織與P-gp有關(guān)。羅丹明-123是一種成熟的P-gp底物。因此，P-gp的藥物泵的活性可通過羅丹明123在細胞內(nèi)積聚的程度來測量[4]。為了測試抗癌Ⅰ號方對P-gp泵的能力，將每孔1×106個BEL7402/5-Fu細胞接種到6孔板中，在37 ℃和5% CO2下孵育24 h。將5-Fu和抗癌Ⅰ號方加入到孔中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后加入5 μg/mL羅丹明-123。37 ℃孵育30 min后，將細胞置于冰上終止反應(yīng)。然后用遇冷的PBS洗滌兩次并收集細胞。然后通過FACSCalibur分析樣品。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和530 nm。

1.8 qPCR檢測肝癌細胞中MDR1、β-actin mRNA表達水平

實驗分組：空白組(BEL7402細胞)、對照組(BEL7402/5-Fu細胞)和抗癌Ⅰ號方組(BEL7402/5-Fu細胞+10%抗癌Ⅰ號方含藥血清)。細胞經(jīng)上述處理24 h后，用TRIzol提取各組細胞的總RNA并按試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(1～2 μg)，用各個基因的特異性引物(見表1)進行PCR擴增。使用相對定量方法比較轉(zhuǎn)錄物量，其中將檢測到的mRNA的量標準化為內(nèi)源對照(β-actin)。

表1MDR1、β-actin引物堿基序列

1.9 Western blot檢測P-gp表達

在許多體外抗藥性細胞系中，可以觀察到P-gp蛋白的過表達，P-gp高表達并被認為是MDR表型之一[5]。我們采用Western blot檢測抗癌Ⅰ號方對結(jié)腸癌細胞P-gp表達的影響。實驗分組：空白組(BEL7402細胞)、對照組(BEL7402/5-Fu細胞)和抗癌Ⅰ號方組(BEL7402/5-Fu細胞+10%抗癌Ⅰ號方含藥血清)。經(jīng)過不同處理的細胞用PBS洗滌兩次，然后收集并用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑RIPA細胞裂解緩沖液提取細胞總蛋白。裂解后離心，12 000 rpm，15 min。按蛋白定量試劑盒說明進行蛋白定量。用12%或8%SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)樣品，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5% BSA封閉兩小時，接著一抗(P-gp、GAPDH，稀釋濃度1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST清洗三遍，然后在37 ℃下將與相應(yīng)的二抗孵育1 h，TBST清洗兩遍后用Kodak掃描系統(tǒng)檢測蛋白條帶, 并使用ImageJ軟件分析條帶蛋白濃度。

1.10 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 抗癌Ⅰ號方降低耐藥肝癌細胞活力

為了評估抗癌Ⅰ號方對耐藥肝癌細胞活力的影響，我們采用MTT進行檢測。結(jié)果(圖1)顯示，與BEL7402細胞相比，在BEL7402/5-Fu細胞活力顯著增高；然而，在用抗癌Ⅰ號方含藥血清處理48 h后，BEL7402/5-Fu細胞活力顯著低。

圖1肝癌細胞活力 與BEL7402/5-Fu細胞比較，*P<0.05

2.2 抗癌Ⅰ號方增強耐藥肝癌細胞內(nèi)羅丹明-123積累

流式細胞儀檢測結(jié)果(圖2)表明，BEL7402細胞的羅丹明-123積累量高于BEL7402/5-Fu細胞的3.16倍；與BEL7402/5-Fu細胞的對照組相比，10%抗癌Ⅰ號方含藥血清使羅丹明-123的積累增加2.08倍。結(jié)果提示，抗癌Ⅰ號方抑制P-gp的細胞外排功能，以增加羅丹明-123的細胞內(nèi)積累，從而降低細胞耐性。

圖2肝癌細胞羅丹明123含量 與BEL7402/5-Fu細胞比較，**P<0.01

2.3 抗癌Ⅰ號方對耐藥基因MDR1表達的抑制作用

P-gp由基因MDR1編碼，我們通過RT-PCR分析以評估抗癌Ⅰ號方對MDR1基因表達的調(diào)節(jié)。結(jié)果(圖3)顯示，對照組MDR1 mRNA顯著增加；然而，用抗癌Ⅰ號方含藥血清處理BEL7402/5-Fu細胞48 h后，MDR1 mRNA的表達顯著降低，甚至低于非抗性BEL7402細胞組。

圖3肝癌細胞內(nèi)MDR1 mRNA表達水平 與BEL7402/5-Fu細胞比較，**P<0.01

2.4 抗癌Ⅰ號方對P-gp蛋白表達的影響

為了評估抗癌Ⅰ號方對P-gp表達的影響，我們采用Western blot進行分析。結(jié)果(圖4)顯示，與BEL7402細胞相比，在BEL7402/5-Fu細胞中檢測到P-gp的高表達；然而，在用抗癌Ⅰ號方含藥血清處理48 h后，P-gp表達顯著降低。

圖4肝癌細胞內(nèi)P-gp蛋白表達水平

3 討論

目前，肝癌患者的治療選擇包括手術(shù)切除，肝移植，分子靶向治療和化療[6]。對于單個腫瘤直徑<5 cm的局部肝癌，根治性手術(shù)切除仍然是首選并且最有效的方法[7]。肝移植被認為是治療終末期肝病或原發(fā)性肝癌患者的有效方法，但預(yù)防移植后肝癌復(fù)發(fā)和提高患者生存率仍然是一個挑戰(zhàn)[8]。近年來，針對表皮生長因子受體，血管內(nèi)皮生長因子和多種氨基酸激酶的小分子靶向藥物已逐漸應(yīng)用于肝癌患者的臨床治療。然而，這些藥物價格昂貴且未廣泛使用[9]。因此，化療對于晚期肝癌患者仍然至關(guān)重要。通常用于肝癌治療的化學(xué)治療藥物包括5-Fu及其衍生物，鉑類(如順鉑，奧沙利鉑)和蒽環(huán)霉素(如阿霉素和多柔比星)[10]。雖然奧沙利鉑，5-Fu和多柔比星的聯(lián)合用藥被廣泛用于治療晚期原發(fā)性肝癌，并且療效可靠，耐受性好，然而其化學(xué)抗性仍然是限制其應(yīng)用的一個持久難題[11]。

中藥作為防治腫瘤的重要組成部分，在輔助化療藥物增強功效、減輕副作用、降低耐藥性方面具有其獨特的優(yōu)勢[12-13]?？拱裉柗綖閺V州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院治療癌癥的經(jīng)驗方，靈芝、鐵皮石斛、白花蛇舌草、藤梨根和蜂蜜組成。方中靈芝滋補脾腎、提高免疫力；鐵皮石斛益胃生津、滋陰清熱；白花蛇舌草、藤梨根清熱解毒，諸藥相合，具有益氣養(yǎng)陰、化瘀解毒的功效。臨床上初步發(fā)現(xiàn)該方對肝癌患者增強機體免疫功能、與化療合用協(xié)同增效及改善提高生存質(zhì)量等多方面有一定的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明靈芝中有效成分靈芝多糖能夠抑制HepG2肝癌細胞體內(nèi)外增殖[14]，鐵皮石斛的有效成分石斛多糖能夠抑制HepG2、Hela、MCF-7等多種腫瘤細胞增殖[15]，白花蛇舌草、藤梨根能夠抑制多種腫瘤的生長[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)抗癌Ⅰ號方能夠抑制耐藥肝癌細胞活力，表明抗癌Ⅰ號方能部分逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細胞的耐藥性。

現(xiàn)代研究表明藥物外排是MDR發(fā)展的關(guān)鍵機制[18]。P-gp也被稱為多藥耐藥蛋白1(MDR1)，是細胞膜中的重要蛋白質(zhì)，可作為外排泵將藥物從細胞內(nèi)排出至細胞外基質(zhì)[19]。P-gp負責(zé)減弱細胞內(nèi)藥物積累和介導(dǎo)MDR。在本研究中，我們檢測了BEL-7402/5-Fu和BEL-7402細胞中P-gp的表達，發(fā)現(xiàn)BEL-7402/5-Fu細胞中P-gp的表達高于BEL-7402細胞。而抗癌Ⅰ號方通過阻斷MDR1 基因轉(zhuǎn)錄顯著抑制P-gp的表達。羅丹明123是P-gp底物和熒光染料。細胞中羅丹明123的累積通常反映P-gp轉(zhuǎn)運能力，通常作為P-gp功能的指標[20]。我們觀察了抗癌Ⅰ號方對P-gp介導(dǎo)的藥物外排的影響發(fā)現(xiàn)，抗癌Ⅰ號方處理后羅丹明123的熒光強度增加，表明抗癌Ⅰ號方可以增加抗癌藥物的積累，從而逆轉(zhuǎn)肝癌細胞的耐藥性。

綜上所述，抗癌Ⅰ號方能夠通過下調(diào)肝癌細胞中P-gp減輕化療藥物外排，逆轉(zhuǎn)肝癌細胞的耐藥性，發(fā)揮抗肝癌作用。