胡志良,阿里木江·阿不拉,王偉,肖永彪

直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，2015年我國結(jié)直腸癌發(fā)病例數(shù)達(dá)37.6萬例，死亡例數(shù)達(dá)19.1萬例，嚴(yán)重危害我國人民健康[1]。目前直腸癌的治療方式包括手術(shù)、放化療及靶向藥物治療等，但對于中晚期患者治療效果不理想，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[2]。由于直腸癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來對直腸癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的研究受到廣發(fā)關(guān)注。Twist基因位于7p21.1，編碼蛋白是具有特征性的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)的Twist轉(zhuǎn)錄因子，其可形成同二聚體和異二聚體，與DNA 中E盒序列結(jié)合并調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程，如調(diào)節(jié)神經(jīng)管閉合、肢體發(fā)育和棕色脂肪代謝等[3]。研究表明，在肺癌、肝癌等多種腫瘤中Twist表達(dá)升高，其能促進(jìn)下游基因如E-鈣黏素(E-cadherin)表達(dá)降低，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，腫瘤細(xì)胞浸潤、侵襲能力增強(qiáng)[4-5]。波形蛋白(Vimentin)位于10p13，該基因編碼Ⅲ型中間絲蛋白，與微管和肌動蛋白微絲一起構(gòu)成細(xì)胞骨架，功能上負(fù)責(zé)維持細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞形狀和完整性，并穩(wěn)定細(xì)胞骨架相互作用，還作為參與細(xì)胞粘附、遷移及信號傳導(dǎo)等許多其他重要生物學(xué)過程。研究表明，腫瘤細(xì)胞中核因子-κB等信號通路的激活能夠促進(jìn)Vimentin表達(dá)升高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞易發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。此外，在非小細(xì)胞肺癌中Twist表達(dá)與Vimentin表達(dá)呈有關(guān)，兩者可能存在表達(dá)調(diào)控的關(guān)系，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究通過檢測直腸癌組織中Twist及Vimentin表達(dá)，分析兩者之間的相關(guān)性，初步探討其作用機(jī)制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2019年3月間在我院診治的80例直腸癌患者的臨床病理資料。其中男性43例，女性37例；年齡29～76歲，平均年齡(53.2±6.1)歲；伴遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移19例，無遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移61例；腫瘤直徑：<5 cm者55例，≥5 cm者25例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期22例；分化程度：高分化19例，中分化30例，低分化31例；浸潤深度：肌層23例，漿膜層57例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：①經(jīng)病理檢查明確診斷為直腸腺癌；②患者既往未接受過放化療、免疫治療等；③患者臨床病理資料和隨訪相關(guān)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有急慢性腸炎、炎癥性腸病等消化系統(tǒng)疾??；②合并急性泌尿系感染、結(jié)核菌感染等感染性疾病；③合并其它器官的惡性腫瘤。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過。

1.2 研究方法

應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測癌組織和癌旁正常組織中Twist及Vimentin的表達(dá)。將術(shù)中新鮮留取(離體30 min以內(nèi))的組織置于EP管中，液氮凍存后置于-80 ℃冰箱保存。取約50 mg的組織標(biāo)本，應(yīng)用Trizol法提取組織中總RNA。以總RNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃5 min，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。Twist正向引物序列：5′-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3′，反向引物序列：5′-GCTTGAGGGTCTGAATCTTGCT-3′；Vimentin正向引物:5′-GACGCCATCAACACCGAGTT-3′，反向引物序列:5′-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3′；內(nèi)參基因GAPDH的正向引物序列5′-CTGGGCTACACTGAG-CACC-3′，反向引物序列:5′-AAGTGGTCGTTGAGG-GCAATG-3′。qPCR反應(yīng)體系20 μL，包括模板cDNA 2 μL，正向及反向引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL, 無RNA酶水6 μL。 Twist qPCR反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環(huán)。Vimentin qPCR反應(yīng)條件為：96 ℃ 10 min，96 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次。Twist及Vimentin的相對表達(dá)量采用2-ΔCt法表示，目的基因Twist或Vimentin的表達(dá)水平相對于內(nèi)參基因GAPDH的比值為2-ΔCt，ΔCt=CtTwist/Vimentin-CtGAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織中Twist、Vimentin表達(dá)比較

直腸癌組織中Twist的相對表達(dá)量為1.081±0.115，顯著高于癌旁組織的0.213±0.051(t=60.713，P=0.000)；直腸癌組織中Vimentin的相對表達(dá)量為2.138±0.216，顯著高于癌旁組織的1.037±0.134(t=38.741，P=0.000)；見圖1。

圖1直腸癌組織與癌旁組織Twist、Vimentin表達(dá)比較

2.2 癌組織中Twist、Vimentin表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系

直腸癌組織中Twist、Vimentin的表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度及漿膜浸潤無關(guān)，見表1。

2.3 直腸癌組織中Twist與Vimentin表達(dá)的相關(guān)性

Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果表明，直腸癌癌組織中Twist的mRNA的相對表達(dá)量與Vimentin的mRNA的相對表達(dá)量呈明顯正相關(guān)(r=0.613，P=0.009)，見圖2。

表1直腸癌組織中Twist、Vimentin表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

圖2直腸癌組織中Twist與Vimentin表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

近年來隨著我國人民生活水平的提高，直腸癌的發(fā)病率逐漸升高，我國每年新發(fā)病例數(shù)約占全球發(fā)病例數(shù)的18%，嚴(yán)重威脅我國人民健康[8]。直腸癌的局部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，手術(shù)難度較大，術(shù)后并發(fā)癥及復(fù)發(fā)率較高，特別是對于局部進(jìn)展期及晚期患者，患者死亡率較高，預(yù)后較差[9]。因此需對直腸癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制進(jìn)行深入研究，尋找具有臨床意義的腫瘤標(biāo)志物。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是使處于靜止穩(wěn)定狀態(tài)的上皮細(xì)胞能夠以單細(xì)胞的形式獲得遷移和侵入的能力的過程。大量研究表明，腫瘤細(xì)胞EMT重新激活，腫瘤細(xì)胞分子表型發(fā)生改變，上皮性表型特征的部分喪失，而部分獲得間充質(zhì)表型，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。

Twist又稱Twist家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1，含有特征性的bHLH結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合靶基因的DNA序列，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。Twist能夠誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞的形成促進(jìn)腫瘤發(fā)生、促進(jìn)原發(fā)性腫瘤生長及腫瘤轉(zhuǎn)移。研究表明，Twist在多種腫瘤中過表達(dá)，Twist的過度表達(dá)誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移形成，靶向藥物抑制Twist及下游相關(guān)分子能夠明顯抑制腫瘤生長、限制腫瘤轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥性，從而提高癌癥患者的存活率[11]。本研究中，直腸癌組織中Twist的mRNA的相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，目前其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，可能與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞間釋放的TNF、TGF-β等細(xì)胞因子增多有關(guān)。研究表明，TNF、TGF-β等能結(jié)合于腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)受體，激活相應(yīng)細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，如核因子κB通路等，促進(jìn)Twist的表達(dá)[12]。本研究中直腸癌組織中Twist的表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明Twist表達(dá)與直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。一方面，Twist表達(dá)水平升高能夠直接結(jié)合并抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(ARF)的表達(dá)，從而抑制P53凋亡信號通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖，凋亡減少，腫瘤分期升高[13]。另一方面，腫瘤細(xì)胞中Twist的表達(dá)升高后，通過調(diào)節(jié)鈣粘蛋白家族的表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤細(xì)胞表面N-鈣黏素表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞間粘附能力下降，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴或血行轉(zhuǎn)移[14]。

Vimentin是中間絲蛋白家族的主要成分，在正常間充質(zhì)細(xì)胞中普遍表達(dá)，維持細(xì)胞完整性及抗應(yīng)激性。Vimentin是EMT的重要標(biāo)志物之一，在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，包括前列腺癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌及肺癌等[15]。腫瘤中Vimentin的過度表達(dá)與腫瘤增殖、侵襲和患者預(yù)后不良密切相關(guān)，因而有可能作為腫瘤診斷、治療的潛在靶標(biāo)。本研究中，直腸癌組織中Vimentin的相對表達(dá)量顯著高于癌旁組織，其機(jī)制可能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制異常有關(guān)。研究表明，腫瘤發(fā)生時負(fù)性調(diào)控Vimentin表達(dá)的微小RNA -145表達(dá)下調(diào)，Vimentin的mRNA穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致Vimentin的表達(dá)水平增加[16]。此外，本研究中，直腸癌組織中Vimentin的相對表達(dá)量與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，較高腫瘤分期及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中Vimentin表達(dá)明顯較高。Vimentin在正常生理?xiàng)l件下維持間充質(zhì)細(xì)胞的可塑性，而在腫瘤中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的作用，機(jī)制可能是Vimentin通過整合來自環(huán)境的機(jī)械輸入信號并調(diào)節(jié)微管和肌動球蛋白網(wǎng)絡(luò)的動力學(xué)來促進(jìn)細(xì)胞遷移，促進(jìn)癌細(xì)胞局部侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[17-18]。本研究進(jìn)一步研究直腸癌癌組織中Twist與Vimentin表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果兩者表達(dá)呈顯著正相關(guān)，表明兩者可能存在直接或間接的相互作用關(guān)系。研究表明，腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路激活后，促進(jìn)Twist等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，Twist能夠直接結(jié)合Vimentin啟動子區(qū)，并促進(jìn)間質(zhì)性表型Vimentin的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移能力[19-20]。

綜上所述，直腸癌組織中Twist與Vimentin均表達(dá)升高，兩者表達(dá)呈明顯正相關(guān)，且均與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有可能成為新的直腸癌診斷、治療及預(yù)后評估的腫瘤標(biāo)志物，但對于兩者之間具體相互作用及調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。