譚林，王騫，屈偉明，艾瓊嘉，陳維順,黃美園

胃癌是嚴重威脅人類生存和健康的惡性腫瘤，我國是全世界胃癌的高發(fā)地域之一，據(jù)統(tǒng)計我國胃癌無論發(fā)病率還是死亡率均高居所有惡性腫瘤前三位[1]。由于早期癥狀不明顯，大部分患者胃癌確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，導致患者不良預后。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染易引起慢性胃炎和消化性潰瘍，已被WHO作為Ⅰ類致癌因素[2]。研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌的毒力因子CagA在胃黏膜上皮細胞可通過激活NF-κB通路發(fā)揮多種生物學效應，如炎性，細胞永生化，細胞增殖，抗凋亡，血管新生，上皮細胞延伸和極性的喪失誘發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)導致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[3-4]。磷酸化p65(p-p65)是NF-κB信號通路重要組成部分，可作為NF-κB信號傳導通路活化的標志[5]。本研究通過檢測胃癌和癌旁正常組織中H.pylori感染情況及p-p65、EMT相關蛋白的表達，探討胃癌組織中H.pylori感染和p-p65、EMT相關蛋白表達之間的關系及其臨床意義，有望為胃癌轉(zhuǎn)移的預測、診斷和藥物或生物治療提供新的線索。

1 對象與方法

1.1 標本收集

收集中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院2014年8月至2016年5月普外科胃癌根治手術切除標本115例，癌旁正常胃組織標本20例(均為手術切緣，病理證實無癌浸潤)?；颊咝g前均未接受放、化療，所有標本均經(jīng)術后病理證實，且已通過Giemsa染色法檢測法判斷患者是否有H.pylori感染。其中陽性68例，陰性47例，男性82例，女性33例，年齡35～86歲(平均年齡61.0歲)?；颊邔Ρ緦嶒灳?，組織標本的獲取和使用均獲得本院倫理委員會批準同意。胃癌組織根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第7版標準進行臨床TMN分期，浸潤深度按照UICC標準中的T分期標準確定，依據(jù)病理標準確認分化程度。所有標本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，脫水、透明、浸蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑

兔抗人p-p65(Ser536)多克隆抗體(ab86299)購自英國Abcam公司，鼠抗人E-cadherin單克隆抗(MAB-0738)、鼠抗人Vimentin單克隆(MAB-0738)抗均購自福州邁新公司。SP試劑盒、DAB顯色劑、中性樹膠封片劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。二甲苯、無水酒精、石蠟、PBS緩沖液、枸櫞酸鈉緩沖液購自廣州瑞斯生物技術有限公司。

1.3 免疫組化染色

常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸高壓修復2.5 min，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，正常山羊血清封閉，滴加一抗(p-p65濃度為1∶800，Vimentin和E-cadherin均為抗體原液)，孵育過夜。DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢及圖像采集分析。

1.4 結(jié)果的判斷

H.pylori感染的判斷：Giemsa染色后在顯微鏡下觀察，胃小凹及腺腔有“S”形分布的紅色顆粒為H.pylori感染陽性，否則為H.pylori感染陰性。

免疫組化結(jié)果判斷：由病理科醫(yī)師雙盲閱片，以胞膜/胞質(zhì)/胞核中出現(xiàn)黃色或黃褐色顆粒視為免疫組織化學染色陽性。免疫組化計分包括染色強度及陽性細胞比例確定。按染色強度分級：無染色或與背景一致的淺黃色為0分，黃色記1分，棕黃色記2分，黃褐色記3分。按陽性細胞比例分級：每片隨機觀察5個高倍鏡視野(200×)，計算染色陽性細胞所占比例：陽性細胞數(shù)<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，>50%計3分。每張切片得分由染色強度評分與陽性細胞比例評分相加所得，0～3分判定為陰性表達，4～6分判定為陽性表達。

1.5 隨訪

通過電話及門診對患者進行隨訪，所有患者均隨訪至2019年7月或至患者死亡，所有患者隨訪資料完整。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁正常胃組織中H.pylori感染及p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達情況

p-p65主要表達于胞質(zhì)和胞核，Vimentin主要表達于胞質(zhì)，E-cadherin主要表達于胞質(zhì)與胞膜。胃癌組織中H.pylori感染率(59.1%)和p-p65、Vimentin陽性表達率(60.0%、34.8%)明顯高于癌旁正常組織(30.0%和35.0%、0.0%)，而胃癌組織中E-cadherin陽性表達率(53.9%)明顯低癌旁正常組織(100%)，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；且p-p65和Vimentin在H.pylori感染陽性胃癌組織中的表達高于H.pylori感染陰性胃癌組織和癌旁正常組織，E-cadherin在H.pylori感染陽性胃癌組織中的表達低于H.pylori感染陰性胃癌組織和癌旁正常組織(圖1、表1)。

圖1p-p65、Vimentin和E-cadherin分別在H.pylori感染陽性胃癌組織、H.pylori感染陰性胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(SP，×200) A、D、G分別為p-p65、Vimentin和E-cadherin在H.pylori感染陽性胃癌組織中的表達；B、E、H分別為p-p65、Vimentin和E-cadherin在H.pylori感染陰性胃癌組織中的表達；C、F、I分別為p-p65、Vimentin和E-cadherin在癌旁正常組織中的表達

表1胃癌和癌旁正常組織中H.pylori感染及p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達

2.2 H.pylori感染及p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關系

胃癌組織中，H.pylori感染和p-p65的表達與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度無相關性；Vimentin和E-cadherin的表達與腫瘤大小、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(P<0.05)，同時Vimentin的表達還與分化程度有關(P<0.05)，與患者性別、年齡無明顯相關性(表2)。

表2H.pylori感染及p-p65、Vimentin和E-cadherin在胃癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關系

2.3 胃癌組織中H.pylori感染與p-p65、Vimentin和E-cadherin表達的相關性

對115例胃癌組織中H.pylori感染與p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達采用Spearman等級相關分析，結(jié)果顯示：H.pylori感染與p-p65、Vimentin的表達呈顯著正相關(rs=0.585，P=0.000、rs=0.260，P=0.005)，而與E-cadherin的表達呈顯著負相關(rs=-0.343，P=0.000)，見表3。

2.4 胃癌組織中p-p65與Vimentin和E-cadherin表達的相關性

對115例胃癌組織中p-p65與Vimentin和E-cadherin的表達采用Spearman等級相關分析，結(jié)果顯示：p-p65與Vimentin的表達呈顯著正相關(rs=0.298，P=0.001)，而與E-cadherin的表達呈顯著負相關(rs=-0.292，P=0.002，表4)。

表3胃癌組織中H.pylori感染與p-p65、Vimentin和E-cadherin表達的相關性分析

2.5 胃癌組織中H.pylori感染、p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達與患者預后的關系

115例患者隨訪36～60個月，均獲得完整隨訪資料，通過Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗比較胃癌患者中H.pylori感染、p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達與患者預后的關系(圖2)。分析顯示：有H.pylori感染及p-p65和Vimentin陽性表達患者總生存率明顯低于陰性表達患者(P=0.017、P=0.011、P=0.022)，E-cadherin陰性表達患者總生存率明顯低于陽性表達患者(P<0.001)。Cox多因素回歸分析顯示：TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、H.pylori感染及E-cadherin表達陰性是影響胃癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表5。

表4p-p65與Vimentin和E-cadherin表達的相關性分析

圖2H.pylori感染、p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達對胃癌患者生存期的影響

表5影響胃癌患者預后的Cox多因素回歸分析

3 討論

我國是胃癌大國，雖然近年來發(fā)病率有所下降，但其在各類惡性腫瘤發(fā)病率與死亡率仍高居第二位。大部分患者一經(jīng)確診便已是中晚期，喪失了手術根治的最佳時機，對患者的生命健康安全造成了嚴重影響。侵襲轉(zhuǎn)移是影響胃癌預后的關鍵因素，是導致胃癌患者死亡的主要原因。

大量研究表明[6]，EMT是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制之一。EMT是指上皮細胞失去極性以及基膜連接等上皮表型，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的生物學過程。通過發(fā)生EMT，腫瘤細胞可以獲得更好的運動、侵襲和抵抗凋亡刺激，并且EMT還可驅(qū)動腫瘤細胞獲得干性潛能，從而實現(xiàn)自我更新、腫瘤起始和化療抵抗等[7]。EMT的主要分子特征：上皮細胞標記物，如E-cadherin表達下調(diào)、β-catenin從胞膜到胞核易位表達；間質(zhì)表型標記物，如波形蛋Vimentin、纖連蛋白Fibronectin等表達上調(diào)[8]。因此，可以通過檢測這些標志物來鑒定EMT的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，Vimentin在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，而E-cadherin則正好相反。同時Vimentin與E-cadherin的表水平與腫瘤大小、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移有關，Vimentin與腫瘤分化程度亦有關性。生存分析提示Vimentin表達陽性患者的生存率明顯低于Vimentin表達陰性患者，E-cadherin則正好相反；多因素Cox回歸分析顯示：E-cadherin表達陰性是影響胃癌患者預后的獨立危險因素。由此可見，EMT在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，且影響患者的預后。

NF-κB是炎癥向腫瘤轉(zhuǎn)變過程中的一個關鍵分子，己成為癌癥的新標志，近來亦被認為是EMT重要的調(diào)節(jié)者[9]。在未受到刺激的正常細胞中，NF-κB亞基與I-κBα、β或γ結(jié)合，以非活性形式被阻滯在胞漿中，當受到TNF-α等炎癥因子刺激后，激活I-κB激酶(IKK)復合物，使IKKβ磷酸化形成p-IKKβ，后者將NF-κB p65/p52二聚體中的p65的Ser536亞基磷酸化(即p-p65)，進而啟動核轉(zhuǎn)錄程序，p-p65進入細胞核內(nèi)發(fā)揮相應的生物學作用，如促進炎癥擴散、對抗細胞凋亡、促進細胞增殖、促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，此為NF-κB信號通路的經(jīng)典激活途徑[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中p-p65的表達明顯高于癌旁正常組織，且其表達水平與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關，表明NF-κB信號通路在胃癌中異常活化，并影響其侵襲轉(zhuǎn)移過程。

H.pylori通常定植于人胃黏膜，它的長期定植引起從慢性胃炎、胃萎縮、腸化生、不典型增生到最終胃癌發(fā)生的胃部疾病的漸變，被認為是胃癌發(fā)生的高危因素[11-12]。Martel等[13]報道，約有75%～90%的非賁門胃腺癌發(fā)病與幽門螺桿菌的感染有關。本研究顯示，胃癌組織中H.pylori感染率明顯高于癌旁正常組織，且在胃癌組織中H.pylori感染與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關，進一步證實胃癌發(fā)生與H.pylori感染密切相關。徐世琴等[14]發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染可導致胃炎患者胃黏膜中核因子NF-кB表達水平升高，隨著患者病情的不斷進展NF-кB表達水平也呈現(xiàn)出升高趨勢。許多研究表明，H.pylori合成分泌的毒力因子CagA可以引起PI3K和Akt的持續(xù)激活，從而導致NF-κB信號通路的活化和EMT相關蛋白表達的變化[15]；此外，CagA與TNF受體相關因子6(TRAF6)和TGF-β活化激酶1(TAK1)相互作用以激活TAK1，TAK1磷酸化并激活IKKβ形成p-IKKβ，最終激活NF-κB信號通路[16]。NF-κB信號通路活化后可啟動Slug、Twist家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1(TWIST1)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(SNAIL)的轉(zhuǎn)錄，從而誘導EMT的發(fā)生[17]。總之，H.pylori感染細胞可以激活NF-κB信號通路，在誘導炎癌轉(zhuǎn)變以及胃癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中起關鍵作用[18-19]。本研究表明，胃癌組織中H.pylori感染與p-p65的陽性表達呈顯著正相關，提示胃癌中H.pylori感染與NF-κB信號通路的活化之間關系密切。同時，胃癌組織中H.pylori感染和p-p65的表達均與Vimentin的表達呈顯著正相關，與E-cadherin的表達呈顯著負相關，提示胃癌中H.pylori感染和NF-κB信號通路的活化與EMT的發(fā)生密切相關。此外，H.pylori感染與p-p65表達陽性的胃癌患者表現(xiàn)出更差的預后和更低的生存率，多因素分析提示H.pylori感染是影響胃癌患者預后的獨立危險因素?；谖墨I報道及結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測H.pylori感染可能導致NF-κB信號通路的異?；罨T導EMT發(fā)生，從而促進胃癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，進而影響患者預后。但本研究結(jié)果表明p-p65的高表達并不能作為胃癌預后的獨立危險因素，原因可能為EMT的發(fā)生還涉及TGF-β、Wnt、Hedgehog、Notch、FAK等多條信號轉(zhuǎn)導通路[20]，NF-κB信號通路可能與上述通路交互作用共同影響胃癌中EMT的進程，具體還需要進一步的研究和探討。

綜上所述，H.pylori感染與NF-κB信號通路的活化及EMT的發(fā)生密切相關，在胃癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。檢測H.pylori感染、p-p65、Vimentin和E-cadherin的表達有助于胃癌患者臨床特征及預后的判斷，而H.pylori感染影響NF-κB信號通路激活與EMT發(fā)生的具體分子機制是我們后續(xù)研究重點。