邢慧，楊珍妮，胡小翠，劉丹

胞漿多聚腺苷序列結合蛋白1 (cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1，CPEB 1)與位于胞漿內(nèi)mRNA 3′非翻譯區(qū)的多聚腺苷序列結合，參與多聚腺苷酸化并調(diào)控多種蛋白的翻譯活化和抑制[1-3]。2006年發(fā)現(xiàn)鼠胚胎成纖維細胞缺失CPEB1即發(fā)生永生化，Burn等人證實了CPEB敲低后會出現(xiàn)轉化細胞的特征，如長端粒保留，線粒體數(shù)量減少，呼吸減少以及糖酵解率增加；此外，CPEB下調(diào)導致p53表達降低約50%，p53 mRNA的polyA尾縮短且翻譯效率下降[4]。盡管CPEB1的抑癌作用在多個組織及動物模型中有所研究，但目前為止，尚無充分、完整的數(shù)據(jù)闡述結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中CPEB1的作用。本研究采用實時定量PCR的方法檢測CPEB1 mRNA的表達情況，探討其與結直腸癌臨床病理特征以及預后的關系，獲得CPEB1表達的初步數(shù)據(jù)，以期為CPEB1作為結直腸癌的潛在治療靶點的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究得到哈爾濱醫(yī)科大學倫理委員會批準,收集2005至2008年哈爾濱醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院接受外科手術的221例結直腸癌患者的癌組織及30例癌旁正常組織。排除術前新輔助放化療、復發(fā)性結直腸癌或其他已知惡性腫瘤者。收集納入患者的一般資料，腫瘤部位、大小、病理及臨床分析，并進行術后隨訪，評估是否出現(xiàn)復發(fā)及轉移。

1.2 方法

1.2.1 RNA分離和定量實時PCR 采用Trizol(TIANGEN，Beijing，China)一步法提取癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤10 cm以上的上皮組織)總RNA。使用ImProm-Ⅱ TM逆轉錄系統(tǒng)(Promega)合成cDNA，應用熒光定量PCR檢測CPEB1 mRNA。 擴增應用SYBRH mRNA(TaKaRa)試劑盒，GAPDH mRNA作為對照。 CPEB1上游和下游引物序列(5′-3′)分別為：GGAAGAAGAAGCAGGAAGGAT和GCATCCTGCTTGTAA-CTGTT。以GAPDH為內(nèi)對照，計算各組CPEB1 mRNA的表達水平。 最終，與配對正常組織中CPEB1 mRNA相比， 結直腸癌組織CPEB1 mRNA的表達水平分為：表達降低(比值≤1)或表達增加(比值>1)兩組[5]。

1.2.2 免疫組織化學分析 應用CPEB1抗體(1∶100稀釋；GTX122410，GeneTex)進行石蠟包埋的組織樣品的免疫組織化學染色，應用二抗(PV-6001，ZSGB-BIO)和3， 3-氨基聯(lián)苯胺(PA109；TIANGEN，北京，中國)顯色。使用蘇木素進行復染。免疫組化結果分別由兩名不知道熒光定量PCR結果的病理專家進行閱片和評分。 根據(jù)McCarty等人報道的免疫組化染色結果評分方法進行評分，該方法綜合染色強度和百分比[6]。

1.3 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0(SPSS，Chicago，IL)軟件進行。計量資料以mean±SD表示，組間差異采用t檢驗； 計數(shù)資料采用百分率表示，組間差異采用2檢驗。相關性分析采用spearman相關性分析進行檢驗；根據(jù)Cox回歸分析進行單變量和多變量生存分析，Kaplan-Meier法分析采用Log Rank檢驗。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CPEB1 mRNA表達

本研究共納入221例結直腸癌患者。 腫瘤組織中CPEB1 mRNA水平表達各異，其中CPEB1 mRNA表達升高(腫瘤/瘤旁比值 > 1)的中位數(shù)為1.57(n=159;范圍為1.01～3.45)，CPEB1 mRNA水平降低(腫瘤/瘤旁比值 ≤ 1)的中位數(shù)為0.53(n=62;范圍為0.23-1.00)。

為了確定CPEB1 mRNA水平是否與CPEB1蛋白表達一致，我們應用免疫組織化學方法(圖1A和1B)檢測了CPEB1 mRNA比值增高(n=20)或降低(n=10)的 30個結直腸癌樣本。 結果顯示，免疫組織化學染色得分與CPEB1 mRNA比值水平一致(P= 1.43×10-4)。

圖1結腸癌組織CPEB1免疫組化染色(SP,×200) A：CPEM1染色陽性; B：CPEB1染色陰性

2.2 CPEB1 mRNA比值與臨床病理資料分析

患者的臨床和病理特征見表1。結直腸癌患者的中位年齡為63.5歲(范圍28～92歲)，大部分為良好/中度分化的Ⅱ期和Ⅲ期腫瘤。 較低的CPEB1 mRNA比值與淋巴結受累顯著相關。單因素分析顯示CPEB1 mRNA與腫瘤大小，部位，病理類型及分化均無顯著相關(見表2)。

中位隨訪時間為48.4個月(范圍為0～95個月)，70.6%的患者生存，其中65.6%的患者無進展生存。 186例非IV期患者的中位隨訪時間53.7個月(范圍為9～95)，其中42例(22.6%)術后出現(xiàn)復發(fā)或轉移。與CPEB1 mRNA比值較高患者相比，較低CPEB1 mRNA比值的患者中位總生存時間顯著降低(P=2×10-5, 圖2A)。低CPEB1 mRNA比值是無進展生存期短的顯著預測因素(PFS;P= 0.001，圖2B)多變量分析顯示，在調(diào)整性別、部位、病理類型、分化和腫瘤分期后，總生存期和無進展生存期與CPEB1 mRNA比值顯著相關(P=2.31×10-4和P=0.002)。

表1結直腸癌患者的臨床病理特征

表2CPEB1信使RNA(mRNA)水平與結直腸癌臨床病理特征的相關性研究

圖2Kaplan-Meier生存曲線 A：Cpeb1 mRNA的表達與納入患者的總體生存期; B: Cpeb1 mRNA的表達與納入患者的無進展生存期

3 討論

多項研究表明，CPEB1通過特異性調(diào)控胞質(zhì)多聚腺苷酸化參與靶基因的翻譯調(diào)控[7-9]。CPEB1在細胞分裂中的M期進入和腫瘤細胞增殖中發(fā)揮重要作用，研究表明CPEB及其家族成員在腫瘤組織中表達下降，可能參與腫瘤細胞的衰老逃逸以及永生化，上皮間質(zhì)轉化等[10-11]。以往的研究結果提示CPEB1是一個潛在抑癌因子，CPEB1的缺失增加了腫瘤易感性。 此外，CPEB1也參與促進惡性細胞進展[12-15]。在CPEB1表達缺陷的乳腺上皮細胞由于β-連環(huán)蛋白和E-鈣粘蛋白定位變化進而導致細胞失去極性，這可能導致上皮間質(zhì)轉化，最終腫瘤增殖和轉移能力增強[11]。綜上所述，CPEB1參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

表3Cpeb1 mRNA水平與結直腸癌患者無進展生存期的多因素分析

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CPEB1 mRNA比值在結直腸癌組織標本中表達不同，CPEB1 mRNA比值降低與患者總體生存和無進展生存期短相關。這為CPEB1在結直腸癌中起到一定的抑癌作用的佐證，也與之前的研究結果報道是一致的。我們的研究結果還顯示，CPEB1 mRNA比值可以作為結直腸癌患者生存的良好獨立預測指標。這與其他一些研究結果一致，例如Yin J、Yin XY等[16-17]的研究顯示CPEB1表達低的膠質(zhì)瘤患者的總體生存期顯著縮短。

綜上，我們的結果證明CPEB1 mRNA比值降低是結直腸癌患者預后差的獨立預測因子；CPEB1可能參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。 然而，本實驗僅為初步試驗，CPEB1的表達機制、調(diào)控機制以及更深入的數(shù)據(jù)，CPEB1在結直腸癌中的作用機制和臨床意義還需要更大規(guī)模的研究去證實。